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羊布鲁氏菌Omp25、VjbR与小鼠巨噬细胞互作蛋白的筛选鉴定

作　者: 屈海龙
导　师: 王兴龙
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 兽医微生物学与免疫学
关键词: 羊布鲁氏菌 Omp25 VjbR 酵母双杂交 cDNA文库
分类号: S852.61
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


布鲁氏菌病（Brucellosis，简称布病）是由布鲁氏菌引起的一种世界性人兽共患传染病。目前，人畜布病主要集中在发展中国家，2000年以后，我国人畜布病有逐年上升的趋势，给畜牧业和人的健康造成了巨大危害。布病难以防控的原因是多方面的，其致病机制、胞内寄生机制不清楚是主要原因。布鲁氏菌能够感染专职巨噬细胞和非专职巨噬细胞，并能在其中生存复制，其中巨噬细胞是布鲁氏菌的主要感染对象。布鲁氏菌之所以能在巨噬细胞内寄生，推测是细菌蛋白与宿主细胞蛋白相互作用的结果。当前，布鲁氏菌蛋白和巨噬细胞蛋白相互作用的机制还不清楚。Omp25属于布鲁氏菌第3组外膜蛋白Omp25/Omp31家族中的一员，研究发现缺失Omp25基因的羊布鲁氏菌突变株不会引起宿主流产，且能够在宿主体内增殖，与其亲本株相比毒力减弱且激发体液免疫的能力也减弱，说明Omp25既是毒力因子又是免疫原性蛋白。VjbR是密度感应系统（Qurum sensing，QS）LuxR蛋白家族的一个转录激活因子，能够影响IV型分泌系统（T4SS）和鞭毛基因表达，并且它在布鲁氏菌毒力和胞内寄生中都发挥了重要作用。鉴于此，本研究构建了羊布鲁氏菌16M株感染小鼠巨噬细胞cDNA文库，并以Omp25、VjbR为诱饵蛋白从该文库中筛选鉴定互作蛋白，为进一步研究布鲁氏菌的分子致病机制和胞内寄生机制奠定基础。首先，利用分子克隆技术对羊布鲁氏菌16M株Omp25、VjbR进行克隆、测序，将其连接到pSos载体上，构建诱饵载体，并检测诱饵载体毒性、自激活性以及膜定位。其次，建立羊布鲁氏菌16M株感染小鼠巨噬细胞模型，提取总RNA，分离、提纯mRNA，构建羊布鲁氏菌16M株感染后的小鼠巨噬细胞cDNA文库，将文库连接到pMyr猎物载体上。然后，将诱饵质粒和pMyr-cDNA文库质粒共转化cdc25H酵母感受态细胞进行互作蛋白筛选，并应用免疫共沉淀技术进行验证。通过以上实验研究，得到如下结果：1、经过测序表明羊布鲁氏菌16M株Omp25、VjbR基因克隆正确，并且成功连接到pSos载体上，构建的诱饵载体对酵母细胞无毒副作用，无自激活性，膜上定位正确，能够用于酵母双杂交实验。2、利用间接免疫荧光实验和透射电镜观察，确立细菌和细胞按照500︰1的比例进行感染，在感染4小时后可以成功建立羊布鲁氏菌16M株感染小鼠巨噬细胞模型。3、成功构建了羊布鲁氏菌16M株感染后小鼠巨噬细胞cDNA文库，并将文库与猎物载体pMyr相连，构建了pMyr-cDNA质粒文库。质粒库容为1.6×109cfu/mL，重组率较高。4、将诱饵质粒和pMyr-cDNA文库质粒共转化cdc25H酵母感受态细胞进行酵母双杂交，结果筛选到2个阳性克隆，经测序两个基因分别为NDAH还原酶装备因子2（Mus musculus NADH dehydrogenase （ubiquinone）1alpha subcomplex,assembly factor2（NM001127346.1），Ndufaf2）和核糖体蛋白S5（Mus musculusribosomal protein S5（NM009095.2），RPS5）。经免疫共沉淀验证Ndufaf2能够与Omp25发生相互作用，RPSs5能够与VjbR发生相互作用。通过上述试验结果，我们提出如下假设：（1）Omp25和Ndufaf2结合后，可以促进细胞中NADH浓度增加，提高NADH活性，降低巨噬细胞对布鲁氏菌的氧化杀伤，从而创造了有利于布鲁氏菌胞内生存的条件。（2）VjbR与RPS5结合后，抑制了RPS5活性，从而抑制了小鼠巨噬细胞的自然凋亡，创造了有利于布鲁氏菌长期感染的环境。这为布鲁氏菌致病机理、胞内寄生机制研究提供了新的思路。本研究为绘制布鲁氏菌与小鼠巨噬细胞相互作用蛋白的网络提供了实验依据，为进一步研究布鲁氏菌的分子致病机制和胞内寄生机制奠定了基础。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-12
英文缩略词表  12-14
前言  14-16
第一篇 研究内容  16-88
  第一章 诱饵表达载体的构建及其毒性和自激活效应检测  16-30
    1 材料与方法  17-21
      1.1 材料  17-18
      1.2 方法  18-21
    2 结果  21-27
      2.1 16M Omp25、VjbR 基因的克隆  21
      2.2 重组质粒 pMD18T-Omp25、pMD18T-VjbR 的构建  21-22
      2.3 诱饵重组质粒 pSos-Omp25、pSos-VjbR 的构建  22-23
      2.4 酵母菌株 cdc25H 的表型验证  23
      2.5 重组诱饵质粒转化酵母及其对酵母细胞的毒性检测  23-25
      2.6 诱饵质粒的自激活检验和定位检验  25-27
    3 讨论  27-30
      3.1 酵母双杂交应用  27
      3.2 Omp25 生物学功能  27-28
      3.3 VjbR 生物学功能  28-30
  第二章 巨噬细胞感染模型的建立及 CDNA 文库的构建  30-56
    1 材料与方法  30-46
      1.1 材料  30-33
      1.2 方法  33-46
    2 结果  46-51
      2.1 羊布鲁氏菌 16M 的培养和菌落计数  46
      2.2 兔抗羊布鲁氏菌 16M 血清的制备  46
      2.3 细胞培养及计数  46
      2.4 羊布鲁氏菌 16M 株感染巨噬细胞间接免疫荧光实验  46-47
      2.5 羊布鲁氏菌 16M 株感染巨噬细胞透射电镜观察实验  47-48
      2.6 羊布鲁氏菌 16M 株感染巨噬细胞后培养及染色  48
      2.7 羊布鲁氏菌 16M 株感染巨噬细胞后巨噬细胞总 RNA 提取和mRNA 分离  48-49
      2.8 羊布鲁氏菌 16M 株感染巨噬细胞 cDNA 合成  49-50
      2.9 cDNA 分级  50-51
      2.10 cDNA 文库构建与质量检测  51
    3 讨论  51-56
      3.1 羊布鲁氏菌 16M 株感染小鼠巨噬细胞模型的建立  51-52
      3.2 羊布鲁氏菌 16M 株感染小鼠巨噬细胞 cDNA 文库的构建  52-56
  第三章 OMP25、VJBR 与羊布鲁氏菌 16M 感染后的巨噬细胞蛋白相互作用研究  56-80
    1 材料与方法  57-68
      1.1 材料  57-60
      1.2 方法  60-68
    2 结果  68-75
      2.1 pCMV-HA-Omp25 与 pCMV-HA-VjbR 质粒构建  68-70
      2.2 共转化 cdc25H 酵母感受态细胞  70
      2.3 转化效率计算  70-71
      2.4 阳性质粒扩增和 PCR、酶切鉴定  71-73
      2.5 阳性质粒验证  73-74
      2.6 猎物蛋白真核表达载体构建  74-75
      2.7 免疫共沉淀实验  75
    3 讨论  75-80
      3.1 羊布鲁氏菌与宿主相互作用研究  75-76
      3.2 关于 CytoTrap 酵母双杂交系统  76
      3.3 酵母双杂交系统的假阳性  76
      3.4 感受态制备和转化效率  76-77
      3.5 Omp25 与羊布鲁氏菌致病性的关系  77
      3.6 VjbR 与羊布鲁氏菌致病性的关系  77-78
      3.7 NADH 的功能及其与布鲁氏菌致病的关系  78
      3.8 RPS5 的功能及其与布鲁氏菌胞内寄生的关系  78-79
      3.9 免疫共沉淀结果  79-80
  结论  80-82
  参考文献  82-88
第二篇 文献综述  88-124
  第一章 布鲁氏菌毒力因子研究进展  88-100
    1 历史回顾  88
    2 布鲁氏菌主要毒力因子  88-95
      2.1 脂多糖（LPS）  89
      2.2 Ⅳ型分泌系统  89-90
      2.3 环β-1,2-葡聚糖（CβG）  90
      2.4 过氧化物歧化酶(SOD)  90-91
      2.5 过氧化氢酶  91-92
      2.6 碱基切除修复  92
      2.7 脲酶  92
      2.8 双组分调节系统(BvrS/BvrR)  92-93
      2.9 烷基氢过氧化物还原酶（ahpC&D）  93
      2.10 细胞色素氧化酶  93-94
      2.11 一氧化氮还原酶  94
      2.12 布鲁氏菌属毒力因子 A（BvfA）  94
      2.13 其他毒力因子  94-95
    参考文献  95-100
  第二章 布鲁氏菌的免疫逃避  100-112
    1 布鲁氏菌免疫学  100-101
      1.1 布鲁氏菌感染小鼠的免疫学  100
      1.2 布鲁氏菌感染人的免疫学  100-101
    2 布鲁氏菌和巨噬细胞  101-103
      2.1 布鲁氏菌与巨噬细胞的相互作用  101
      2.2 吞噬作用  101-102
      2.3 巨噬细胞内的布氏小体运输  102
      2.4 其他反应  102-103
    3 布鲁氏菌逃避免疫的分子机制  103-105
      3.1 脂多糖机制  103-104
      3.2 磷酸卵磷脂机制  104
      3.3 环葡聚糖机制  104
      3.4 virB 操纵子机制  104-105
    4 布鲁氏菌免疫逃避的 cAMP/PKA 信号通路  105-106
    参考文献  106-112
  第三章 酵母双杂交系统研究及其应用  112-124
    1 酵母双杂交技术  112
    2 酵母双杂交基本原理  112-113
    3 现有酵母双杂交系统及其优点  113-116
      3.1 在核内完成的酵母双杂交系统  114
      3.2 在胞质内或胞膜上完成的酵母双杂交系统  114-115
      3.3 在胞外或跨膜蛋白上完成的酵母双杂交系统  115-116
    4 酵母双杂交技术主要应用  116-117
      4.1 研究与靶蛋白相互作用蛋白  116
      4.2 研究病毒蛋白  116
      4.3 研究蛋白相互作用网络  116-117
      4.4 研究药物筛选和作用靶点  117
    5 酵母双杂交系统优点与缺点  117-118
      5.1 酵母双杂交系统优点  117
      5.2 酵母双杂交系统存在不足  117-118
    6 前景展望  118-119
    参考文献  119-124
个人简历  124-126
致谢  126-128
导师简介  128

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 病原细菌
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