学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

布鲁氏菌vjbR基因标记疫苗株的构建、免疫保护性分析及鉴别诊断研究

作　者: 白耀霞
导　师: 田晋红；陈泽良
学　校: 西南大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 布鲁氏菌 vjbR 标记疫苗株融合PCR 免疫保护诊断抗原
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 73次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

布鲁氏菌病是一种在世界范围内广泛流行的人畜共患病,它的流行不仅对社会经济发展造成了严重损失,而且给人类健康带来很大威胁。减毒活疫苗是目前预防布鲁氏菌病效果最好的疫苗形式,在国内外有广泛的使用,然而,由于存在毒力残存、免疫后无法鉴别诊断等缺点,其使用受到限制。为了克服现有疫苗的这些缺点,利用敲除抗原基因的方法构建标记疫苗株,并评价标记株作为候选减毒活疫苗的可行性,已成为寻找理想减毒活疫苗的一种重要策略。根据文献报道相关标记疫苗株的研究情况,在实验室前期研究成果的基础上,本研究进一步对16M△vjbR作为标记疫苗株的可行性进行了评价。首先采取抗性替换的方法,重新构建了vjbR抗性基因替换株,然后对标记菌株的毒力表型进行了确认,对其保护性和保护机制进行了分析。之后,进行了vjbR的体外克隆、表达,并探讨其区分疫苗免疫与自然感染的能力,建立了鉴别诊断方法。由于布鲁氏菌不含质粒,很多外源质粒均不能在细菌中复制,基于此特点,我们建立了一种快速构建布鲁氏菌无痕缺失突变体的方法,并成功构建了vjbR的突变株：将vjbR基因两侧同源臂分别与卡那抗性基因进行PCR融合,得到含有两侧同源臂和抗性基因的突变盒序列,然后利用T载体克隆,将突变盒序列克隆到T载体,将得到的重组载体转入布鲁氏菌中,通过抗性筛选得到vjbR基因被卡那基因替换的缺失标记株16M△vjbR。用16M△vjbR标记株腹腔接种免疫小鼠,在免疫后的2、4、6周分别采集免疫小鼠血清,监测抗体产生,分离小鼠的脾脏,用菌体蛋白刺激,分析免疫后小鼠的细胞免疫,进行免疫保护性研究。实验中我们采用了疫苗株Rev.1免疫组做为阳性对照,生理盐水PBS组作为阴性对照。实验结果显示,用缺失标记株16M△vjbR免疫的BALB/c小鼠能够对野生株B.melitensisl 6M产生很好的免疫保护效果。同时,突变株诱导了特异性抗体IgG的分泌。其细胞免疫水平IFN-γ以及IL-10均有分泌。这说明缺失标记株16M△vjbR能够诱导细胞免疫和体液免疫,并起到明显的保护作用。缺失标记株16M△vjbR能否作为候选疫苗还与是否有合适的诊断抗原有关。我们对布鲁氏菌重组蛋白vjbR进行了体外表达,分别用缺失标记株16M△vjbR、野生株B.melitensis16M免疫BALB/c小鼠,用免疫的小鼠血清与纯化的蛋白反应来评价蛋白作为诊断抗原的可能性。通过Western blot和间接ELISA法对蛋白的免疫原性进行了检测,结果显示vjbR能够作为诊断抗原,可用于区分疫苗免疫和自然感染。以上结果表明,16M△vjbR是一个良好的候选减毒活疫苗株,值得进一步研究。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-8
第一章文献综述  8-15
  1.布鲁氏菌病原  8
  2.布病的危害  8-9
  3.布病的治疗与防护  9-12
  4.布鲁氏菌的QS系统  12-13
  5.布病病原的诊断  13-14
  6.布鲁氏菌突变株的构建方法  14-15
第二章引言  15-16
第三章利用T载体克隆快速构建布鲁氏菌vjbR缺失标记株  16-23
  3.1 材料  16-17
    3.1.1 菌株和质粒  16
    3.1.2 引物  16
    3.1.3 主要试剂  16-17
    3.1.4 主要仪器  17
  3.2 方法  17-19
    3.2.1 融合PCR法构建突变载体  17-18
    3.2.2 布鲁氏菌的电转化  18-19
    3.2.3 突变体的筛选与鉴定  19
  3.3 结果  19-22
    3.3.1 基于T载体克隆构建缺失突变株的原理  19-20
    3.3.2 目的片段的扩增  20-21
    3.3.3 缺失突变盒的构建  21
    3.3.4 缺失突变载体的构建  21
    3.3.5 突变体的筛选与鉴定  21-22
  3.4 讨论  22-23
第四章布鲁氏菌基因标记疫苗株16M△vjbR的免疫保护性分析  23-30
  4.1 材料  23-24
    4.1.1 菌株、细胞、小鼠  23
    4.1.2 主要试剂  23
    4.1.3 主要仪器  23-24
  4.2 方法  24-25
    4.2.1 菌液制备  24
    4.2.2 免疫保护实验  24
    4.2.3 体液免疫反应水平  24-25
    4.2.4 细胞因子水平测量  25
  4.3 结果  25-28
    4.3.1 16MAvjbR的免疫保护作用  25-26
    4.3.2 16M△vjbR诱导的体液免疫反应  26-27
    4.3.3 16M△vjbR的细胞免疫反应  27-28
  4.4 讨论  28-30
第五章 VjbR表达及基因标记株16M△vjbR的鉴别诊断  30-39
  5.1 材料  30-31
    5.1.1 菌株与载体  30
    5.1.2 引物  30-31
    5.1.3 主要试剂与溶液配制  31
    5.1.4 主要仪器  31
  5.2 方法  31-34
    5.2.1 表达载体的构建及重组蛋白的表达  31-33
    5.2.2 重组蛋白的纯化  33
    5.2.3 Western Blot检测  33
    5.2.4 间接ELISA检测  33-34
  5.3 结果  34-38
    5.3.1 目的基因的扩增  34
    5.3.2 入门克隆的构建  34
    5.3.3 表达载体的构建  34-35
    5.3.4 重组蛋白的诱导表达  35
    5.3.5 重组蛋白表达形式的确定  35-36
    5.3.6 重组蛋白纯化结果  36
    5.3.7 重组蛋白免疫原性分析  36-38
  5.4 讨论  38-39
第六章研究总结与创新点  39-40
参考文献  40-45
附录  45-46
致谢  46-48
发表论文情况  48

布鲁氏菌vjbR基因标记疫苗株的构建、免疫保护性分析及鉴别诊断研究

内容摘要

全文目录

相似论文