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我国流行C基因型野生和耐药HBV稳定复制细胞系的建立及应用

作　者: 王琳
导　师: 徐东平; 刘妍
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 免疫学
关键词: 乙型肝炎病毒稳定复制细胞模型耐药
分类号: R512.62
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染呈世界性流行，不同地区流行强度不同，近30年来预防性乙肝疫苗的广泛使用使得我国成为HBV中度流行性区，但是对于约9300万感染者含2000万慢性乙型肝炎患者的现状，治疗方面仍然面临严峻的挑战。由于乙肝病毒基因组序列的高度异质性，可将其分为9种主要基因型（A-I），各类基因型病毒的生物学特性、对药物的反应性、疾病进展和临床转归都不同，我国最常见的是基因型B和C，是我国HBV患者易进展成为肝纤维化、肝衰竭和罹患肝细胞癌的原因之一。当前，慢乙肝治疗的总体目标是：最大限度地长期抑制HBV，减轻炎症和纤维化，延缓疾病进展及并发症的发生。核苷（酸）类药物（NAs）是临床最常用的抗HBV感染治疗药物，拉米夫定（lamivudine, LAM）、恩替卡韦（entecavir, ETV）、替比夫定（tebivudine, LdT）和阿德福韦酯（adefovir dipivoxil, ADV）四种已在我国上市，替诺福韦酯（tenofovir disoproxil fumarate, TDF）仍处于临床实验阶段，它们直接作用于HBV的逆转录酶（RT）区，可显著抑制病毒的复制却无法清除肝细胞内的共价闭合环状D(covalently closed circular DNA, cccDNA)。因此，长期抗病毒治疗虽然抑制了病毒复制，但预存于准种群中的极少量变异株在药物压力下获得选择性扩增引起病毒突破，导致治疗失败。建立细胞模型是研究病毒感染史、生物学特性，评价药物疗效，优化治疗方案，研发新药疫苗高效便捷的技术手段。病毒感染类细胞模型，由于HBV种属和组织特异性要求严格，培养条件苛刻，对病毒敏感度低，应用受限。以肝癌细胞系为基础的病毒瞬时转染系统难以维持病毒稳定长期的复制，不适于需要标准化的实验，如药敏实验。20余年来国内外建立了一些可以复制和分泌HBV病毒颗粒的稳定细胞系，如世界公认的HepG2.2.15细胞；其他一些实验室为满足抗病毒耐药变异研究的需求，相继建立了耐药突变HBV稳定复制细胞株。但是现有成熟细胞模型存在一些问题：首先是稳定性不高，同时难以模拟自然复制状态；其次缺少我国流行的B和C基因型毒株稳定复制细胞系；另外人为诱导突变细胞株，不能反应病毒的自然遗传特征。直接从中国乙肝患者血清分离克隆野生型或者含有耐药突变位点的HBV全长基因组序列，建立中国流行的基因型稳定复制细胞模型，对于抗病毒药物评价及防治方案的本土化具有积极作用。本研究旨在建立我国流行HBV稳定复制细胞模型，基因来源于中国患者流行的C基因型HBV分离株，利用病毒与HepG2肝癌细胞系基因整合方法获得具有代表性的不同耐药形式的稳定复制细胞系，期望能够用于各种核苷和核苷酸类似物的药敏实验分析，为抗HBV新药药效评价提供理想的细胞模型。目的建立中国患者流行的C基因型野生、恩替卡韦耐药变异和多重耐药变异HBV稳定复制细胞系，能够支持HBV长期高水平复制并稳定表达病毒抗原和分泌完整病毒颗粒，并应用于药物体外抑制HBV作用评价。方法(1)本研究血清样本来源于解放军第302医院确诊的慢性乙型肝炎患者，提取HBVDNA，对逆转录酶区（RT）/表面抗原（S）区进行聚合酶链式反应（PCR）和双向测序分析，根据RT/S区序列应用MEGA4软件进行分子进化树分析并分型，对其中3例具有代表性的C基因型HBV（野生株wt、恩替卡韦耐药株ETVr、多重耐药株MDR）进行全长基因扩增、测序和全长克隆，根据病毒序列特征设计引物，逐步克隆至pCDNA3.1(+)以及pTriEx-mod真核表达载体上，得到1.38倍体及1.1倍体HBV重组复制子，转染HepG2细胞。以新霉素G418筛选具有抗性的阳性细胞克隆，对分泌到上清中的HBV DNA进行全长PCR鉴定。(2)检测分泌上清中HBV表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg）以及HBV DNA，保留高表达细胞株，将其有限稀释以获得单一细胞来源的稳定复制细胞系。通过ELISA、免疫组化方法检测病毒主要抗原水平；通过Southern印迹、实时荧光定量PCR检测细胞HBV复制中间体核心颗粒DNA和培养上清中分泌的病毒DNA载量；以滚环扩增结合跨缺口实时荧光定量PCR检测细胞内HBV cccDNA，评估稳定细胞克隆的复制表达情况；通过透射电镜观察证实细胞分泌乙肝病毒颗粒。(3)用目前常见核苷（酸）类似物： LAM、ETV、ADV及TDF四种药物进行药物敏感性实验，评价各细胞株实际应用效果。结果(1)构建C基因型1.38倍HBV野生株以及1.1倍ETVr和MDR表达载体分别为pN31-51-6-1、pTriEX-1.1-63-2、pTriEX-1.1-37-17，经过转染筛选和亚克隆，获得相应的稳定复制细胞克隆分别命名为HepG2.51-6-1、HepG2.A64和HepG2.1403F，培养上清全长PCR产物测序结果与原病毒序列完全一致。(2) HepG2.51-6-1（1.38wt）、HepG2.A64（1.1ETVr）、HepG2.1403F（1.1MDR）建系后具有高抗原表达和稳定复制能力，分别传代60代（29个月）、400代（44个月）和260代（29个月）；平均HBsAg/HBeAg吸光度值为3.25±0.41/3.13±0.47、1.83±0.78/1.32±0.63和2.24±0.74/1.0~8±0.26；免疫组化染色直观可见细胞内病毒蛋白的表达。平均HBV DNA复制水平（分泌上清/核心颗粒）分别为4.53×10~5/4.57×10~7拷贝/ml、1.77×10~5/7.41×10~7拷贝/ml和2.63×10~5/2.34×10~8拷贝/ml；cccDNA分别为9.6、22和6.8个/细胞；Southern blot结果显示存在病毒复制中间体的松弛环状DNA(relaxed circular DNA, rcDNA)、双链DNA(double strands DNA，dsDNA)和单链DNA（single strand，ssDNA）三条清晰显影带。透射电镜下观察可见到42nm左右大颗粒和20nm左右小球型颗粒。(3)细胞株HepG2.51-6-1对于四种药物均敏感；HepG2.A64对ETV具有高水平的耐药性，同时存在LAM交叉耐药，对ADV和TDF仍然敏感；HepG2.1403F对LAM、ETV和ADV耐药，对TDF敏感。表型耐药分析符合耐药特征。结论成功建立了中国患者流行的C基因型野生、恩替卡韦耐药变异和多重耐药变异HBV稳定复制细胞系HepG2.51-6-1、HepG2.A64和HepG2.1403F，能够支持HBV长期高水平复制并稳定表达病毒抗原和分泌完整病毒颗粒。我们建立的细胞模型改变了一直依赖国外建立的D基因型HepG2.2.15细胞的局面，这些细胞系为我国HBV病毒学及抗病毒研究提供新的工具。

全文目录

缩略词表  4-5
中文摘要  5-8
Abstract  8-12
前言  12-14
第一部分 HBV 稳定复制细胞株的建立  14-38
  第一节不同的构建策略构建 HBV 的真核表达载体  14-24
    一、材料与方法  14-19
    二、结果  19-22
    三、讨论  22-24
  第二节稳定复制细胞系的建立  24-38
    一、材料与方法  24-32
    二、结果  32-36
    三、讨论  36-38
第二部分 HBV 稳定复制细胞株的应用  38-43
  一、材料与方法  38-39
  二、结果  39-41
  三、讨论  41-43
全文总结及创新点  43-44
参考文献  44-46
文献综述  46-51
  参考文献  49-51
个人简历  51-52
致谢  52

我国流行C基因型野生和耐药HBV稳定复制细胞系的建立及应用

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