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干扰素诱导的DAI蛋白抑制乙型肝炎病毒复制的初步研究

作　者: 陈奇英
导　师: 袁正宏
学　校: 复旦大学
专　业: 病原生物学
关键词: 乙型肝炎病毒 干扰素 DNA依赖的干扰素调节因子激活蛋白(DAI) 抗病毒活性 核因子kappaB(NF-κB)
分类号: R512.62
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


干扰素诱导蛋白DAI抑制乙型肝炎病毒复制的初步研究硕士学位论文中文摘要乙型肝炎病毒(HBV)是危害人类健康的主要病原体之一,在全球范围内,有近四亿感染者,由此引发的肝炎肝硬化以及肝癌每年导致近百万人的死亡。干扰素是一类具有广谱抗病毒作用的细胞因子,自其1957年被发现以来已经受到大量的关注并被广泛应用到病毒感染的临床治疗中,但是其抑制HBV复制的机理还不甚明了。先前的研究表明干扰素可以通过诱导抗病毒蛋白(MxA,APOBE3,MyD88)的表达来发挥其抑制HBV复制的作用,但是这些蛋白并不能揭示干扰素抑制HBV复制的全部机理,提示还有其他抗乙型肝炎病毒的干扰素诱生蛋白的存在,值得进一步寻找新的受干扰素诱导的抑制HBV复制的蛋白并揭示其抑制HBV复制的机理。基因微点阵芯片技术(Micro array)的发展和应用使得有可能从新的角度研究干扰素抗病毒的机制及寻找新的抗病毒蛋白,已经有不少利用cDNA基因芯片技术检测经干扰素处理后的人类肝细胞或者试验动物的肝细胞的基因表达谱的变化,Chisari,F.V等发现,对有HBV复制的小鼠肝细胞(HBVMet4)用干扰素处理六小时后,IFN-γ和IFN-β可以使DAI (DNA-dependent activator of IFN-regulatory factor,也叫Z-DNA binding protein (ZBP1)或者DLM-1)的表达量分别升高426和577倍。DAI最初作为一种RNA结合蛋白被发现,其可以与β-actin mRNA的zipcode结构高特异性结合来决定β-actin mRNA的细胞内定位从而来维持细胞的极性。而后Yineng Fu等发现在巨噬细胞DAI可以被IFN-γ或者LPS刺激后上调,被称为肿瘤基质和激活巨噬细胞蛋白(Tumor stroma and activated macrophage protein),提示在宿主天然防御中发挥重要的作用。2007年Tadatsugu Taniguchi等证明DAI作为DNA识别蛋白可以与IRF3和TBK1相互作用并能强烈地诱导Ⅰ干扰素的产生。由此可以推测DAI可能在干扰素介导的抗HBV复制中发挥着重要的作用。本研究首先证实了IFN-α可以在肝癌来源的Huh7细胞内诱导DAI的mRNA水平的上调。随即将DAI蛋白的表达质粒与HBV的复制型质粒HBV1.3共转Huh7细胞后,发现DAI可以明显地下调乙肝表面抗原(HBsAg)以及e抗原(HBeAg),细胞内HBV RNA及HBV核心颗粒DNA的水平。鉴于poly(dA-dT).poly(dT-dA) (B-DNA)是一种可以强烈诱导DAI表达的人工合成DNA,在HBV的复制的Huh7细胞中加入B-DNA可以诱导DAI的表达并抑制HBV的复制。由此提示外源性及内源性的DAI都可以抑制HBV的复制。DAI作为一种诱导干扰素产生的重要分子,其对HBV的抑制作用是否与诱导干扰素的产生相关?研究表明DAI可以与TBK1相互作用后通过招募干扰素调节因子3(IRF-3)进而诱导干扰素的产生,其抑制HBV的作用是否与此相关,为此我们首先在Huh7细胞内过表达TBK1,结果发现其并不能增强DAI对HBV的抑制作用。进而我们将DAI与IRF-3共转细胞,检测IRF-3的活化程度,结果显示IRF-3的入核和磷酸化都无明显变化,我们将DAI与IRF-3的永久失活体质粒(失去N端的DNA结合区域的截短体(IRF-3△N))共转细胞,发现IRF-3△N并不影响DAI对HBV的抑制作用,由此提示Huh7细胞内DAI不能激活IRF-3,DAI抑制HBV复制不依赖于TBK1/IRF-3介导的干扰素产生。NF-κB是固有抗病毒免疫中的一个重要的转录因子,研究发现B-DNA诱导的NF-κB的DNA结合活性中DAI有重要的作用,本研究的实验也证明DAI能以剂量依赖的方式激活NF-kB转录启动活性。我们进一步应用NF-κB的超抑制剂I kBα-SR(superrepressor)发现可以回复DAI对HBV的抑制作用,这提示DAI抑制HBV的活性可能与其激活NF-KB的相关。NF-κB活化后可以启动包括干扰素在内的抗病毒细胞因子的转录,为探索DAI抑制HBV是否依赖于其对干扰素的诱生,我们首先在RNA和蛋白水平检测DAI在Huh7细胞内能否诱导干扰素产生,结果发现DAI不能诱导干扰素的产生。为了进一步排除干扰素或者其他分泌到细胞外的细胞因子是DAI发挥抑制HBV的效应因子,我们做了上清置换试验,将转染了DAI的细胞上清加入到HBV复制的细胞中,结果并未发现DAI表达的细胞上清具有抑制HBV的复制的效应。综上所述,本文的结果证明DAI (ZBP1/DLM-1)是一种具有抗乙型肝炎病毒活性的干扰素诱生蛋白,过表达DAI可以下调HBV RNA,复制中间体DNA以及e、s抗原水平,这种下调可能与激活NF-κB的活性相关但不依赖于它对干扰素产生的诱导。以上发现丰富了对干扰素抗病毒作用机制的认识,为HBV感染的治疗提供了新的思路和实验基础。

全文目录


摘要  4-7
Abstract  7-10
前言  10-12
材料与方法  12-24
结果  24-46
讨论  46-49
参考文献  49-52
综述  52-64
  参考文献  59-64
附录  64-65
致谢  65-66

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 传染病 > 病毒传染病 > 病毒性肝炎 > 乙型肝炎
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