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宿主miRNA抑制A型流感病毒复制的作用研究

作　者: 郭振东
导　师: 王玉民
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物安全
关键词: A型流感病毒聚合酶蛋白核蛋白微小RNA 靶向
分类号: R373.13
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

A型流感病毒属于正粘病毒科，单股负链的RNA病毒。由于其宿主广泛、传染性强、传播速度快，短时间内可造成局部地区的爆发或全球范围的流行。自19世纪以来，已爆发四次全球性的流感大流行，其中1918年爆发的“西班牙流感H1N1”大流行最为严重，造成全世界近5000万人死亡，给人类健康和全球经济带来了极大的危害。目前，针对A型流感病毒感染的预防和治疗措施主要是采用离子通道阻断剂和神经氨酸酶抑制剂等抗病毒药物，但是这些药物对于人体神经系统均有一定的副作用，而且由于A型流感病毒基因变异快，随着药物的大量使用，极易产生耐药性毒株。因此，进行流感病毒治疗药物及抗病毒靶标研究迫在眉睫。微小RNA（miRNA）是长度约22nt的非编码单链小RNA分子，广泛存在于真核生物基因组中，其基因位置及序列都十分保守。miRNA主要通过互补结合到靶标mRNA上而起到转录后基因表达调控的作用，参与许多细胞过程，包括细胞增殖、分化、凋亡和肿瘤形成等。目前，已有研究表明宿主miRNA在乙肝病毒、丙肝病毒及人类免疫缺陷病毒等多种病毒感染中通过对宿主或病毒的基因表达进行调控，从而影响病毒复制、侵染及致病等过程。此外，由于miRNA的作用途径专一且效果明显，miRNA及其靶点已成为治疗病毒性疾病特效基因药物的研究热点。A型流感病毒基因组由8个节段组成，前三个节段编码聚合酶蛋白PB2、PB1和PA，三者共同组成RNA依赖的RNA聚合酶蛋白复合体。第五个节段编码核蛋白NP，包裹着病毒的核酸，起保护作用。在流感病毒复制过程中NP、病毒RNA及三个聚合酶蛋白共同组成核糖核蛋白复合体（RNPs），不仅参与病毒基因的转录与翻译，还在病毒RNA及蛋白的入核、出核及胞质聚集过程中发挥着重要的功能。这四个基因节段不仅功能重要，而且存在很多保守位点，因此针对以上基因寻找新的药物靶位，研制稳定的抗流感病毒药物具有举足轻重的作用。本研究以流感病毒聚合酶蛋白基因和核蛋白基因为靶点，寻找广谱调控A型流感病毒复制的宿主miRNA并确定miRNA的靶位点，为宿主抗病毒防御机制提供更深层次的理解，也为应用生物信息学方法来开发广谱抗流感病毒的基因药物及寻找新抗病毒靶点奠定基础。本研究首先利用生物信息学方法预测并筛选广谱靶向A型流感病毒复制相关基因的宿主miRNA。我们以miRNA靶标预测软件miRanda为主体，设计了广谱靶向A型流感病毒基因的宿主miRNA的预测筛选流程。采用Perl语言编程从miRanda软件输出结果中提取有用信息，并通过设定严格的软件参数，制定详尽的筛选原则，使筛选出的miRNA兼具广谱靶向率高与抑制病毒复制效果好等优点。针对PB2基因，挑选了miR-188-3p和miR-345；针对PB1基因，挑选了miR-3183；针对PA基因，挑选了miR-15a*和miR-99b*；针对NP基因，挑选了miR-769-3p；筛选的6个miRNA对A型流感病毒的广谱靶向率分别为81.3%，95%，78.7%，83.1%，64.4%和95.3%。随后从季节性流感病毒A/FM/1/47（H1N1）毒株中扩增PB1、PB2、PA及NP基因全长并构入T载体中，通过测序获得了该毒株的基因序列，miRanda软件预测结果显示所筛选的6个miRNA在该毒株上均具有良好的靶向性，碱基对匹配结合模式具有代表性，可以利用该毒株进行miRNA的功能验证。采用一系列实验方法逐步验证miRNA抑制A型流感病毒复制的效果。1.首先采用双荧光素酶报告基因系统进行初步筛选，根据miRNA的荧光抑制率判定miRNA与潜在靶标的结合能力。结果显示生物信息学筛选出的6条miRNA与潜在靶标均有一定的结合能力，但是靶向于PA基因的miR-15a*和miR-99b*荧光抑制率较小，仅为28.82%和20.75%；其余4条miRNA与潜在靶标结合能力较强：miR-188-3p和miR-345可靶向结合PB2基因，miR-3183可靶向结合PB1基因，三者荧光抑制率均达到45%左右。miR-769-3p可靶向结合NP基因，荧光抑制率为36.5%。2.进一步验证miRNA对A型流感病毒蛋白表达的影响。首先构建了表达PB1、PB2、PA及NP蛋白基因的真核表达载体，并与人工合成的miRNA模拟物共转染HEK293T细胞。Western印迹结果显示4条miRNA均可显著抑制相应病毒蛋白的表达。其中miR-769-3p对NP蛋白表达的抑制效果最为显著。miR-188-3p和miR-345对PB2蛋白表达的抑制效果、miR-3183对PB1蛋白表达的抑制效果与阳性对照miRNA（miR-491）对靶标蛋白PB1蛋白表达的抑制效果基本一致。3.最后，观察miRNA对A型流感病毒复制的抑制效果。首先验证了季节性流感病毒A/FM/1/47（H1N1）毒株在MDCK细胞系及A549细胞系上的复制动力学特性，绘制了一步生长曲线，确定了病毒最佳接毒剂量，随后利用最佳病毒感染剂量进行了miRNA抑制流感病毒复制实验。实验结果表明miR-188-3p可显著抑制A型流感病毒在A549细胞上的复制，与对照组相比，病毒感染后48h病毒滴度降低0.8个TCID50。miR-345效果其次，可使病毒感染后48h病毒滴度降低0.51个TCID50。二者均优于阳性对照miR-491，其仅使病毒感染后48h病毒滴度降低0.43个TCID₅₀。基于以上研究，我们通过生物信息学预测及一系列实验验证最终筛选到一个miRNA，即miR-188-3p，可广谱靶向结合A型流感病毒PB2基因，抑制PB2蛋白表达，显著抑制A型流感病毒的复制。不仅如此，我们通过生物信息学方法分析发现miR-188-3p对近期爆发的人感染H7N9禽流感病毒PB2基因也具有很好的靶向性，而且其靶向效果优于A/FM/1/47（H1N1）毒株。本研究的成果为宿主抗流感病毒防御机制提供了更深层次的理解，同时提出了一种广谱靶向抑制流感病毒的miRNA筛选方法，为应用生物信息学方法来挖掘抗A型流感病毒的miRNA基因药物的研究奠定了理论基础。

全文目录

缩略词  5-6
摘要  6-9
ABSTRACT  9-13
前言  13-23
  1 A 型流感病毒概况  13-15
    1.1 A 型流感病毒治疗药物研究概况  14-15
  2 miRNA 简介  15-17
    2.1 miRNA 基因  15
    2.2 miRNA 的合成过程  15-17
    2.3 miRNA 的作用机制  17
  3 miRNA 与病毒  17-21
    3.1 病毒编码的 miRNA 调节病毒和宿主基因表达  18-19
    3.2 宿主 miRNA 在病毒感染过程中的调节作用  19-20
    3.3 miRNA 作为抗病毒靶基因药物前景  20-21
    3.4 miRNA 靶标预测软件  21
  4 本论文的目的意义与研究思路  21-23
第一章生物信息学筛选广谱靶向 A 型流感病毒复制相关基因的宿主 miRNA  23-32
  1 实验数据及方法  23-27
    1.1 硬件设备  23
    1.2 miRanda 软件安装与参数设置  23-24
    1.3 人成熟 miRNA 的序列  24-25
    1.4 人感染 A 型流感病毒的序列  25-27
  2 实验结果  27-30
    2.1 数据采集及 miRNA 靶标预测  27-28
    2.2 miRNA 靶标预测结果的定性分析  28-29
    2.3 广谱靶标 A 型流感病毒复制相关基因的 miRNA 筛选  29-30
  3 小结与讨论  30-32
第二章宿主 miRNA 抑制 A 型流感病毒复制的功能验证  32-61
  1 实验材料及仪器  32-37
    1.1 载体、菌株、细胞及毒株来源  32
    1.2 主要试剂  32-34
    1.3 主要试剂的配制  34-36
    1.4 主要仪器  36-37
  2 实验方法  37-46
  3 实验结果  46-58
    3.1 A 型流感病毒 PB1、PB2、PA 及 NP 基因的扩增及分析  46-48
    3.2 预测的 miRNA 在 A 型流感病毒上与靶基因的结合能力分析  48-50
    3.3 预测的 miRNA 对 A 型流感病毒蛋白表达的抑制作用  50-54
    3.4 预测的 miRNA 对 A 型流感病毒复制的抑制作用  54-58
  4 小结与讨论  58-61
结论  61-62
参考文献  62-67
文献综述  67-77
  参考文献  74-77
研究论文  77-88
个人简历  88-89
致谢  89-90

宿主miRNA抑制A型流感病毒复制的作用研究

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