学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

人类胸腺核苷酸合成酶结构及其与抑制剂相互作用关系

作　者: 谭圆
导　师: 康从民
学　校: 青岛科技大学
专　业: 药物化学
关键词: 人类胸苷酸合成酶原核表达亲和层析透析复性结晶胸苷酸合成酶抑制剂
分类号: Q55
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 39次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

胸苷酸合成酶（Thymidylate synthase,TS）能催化生物体内的2′-脱氧尿苷-5′-磷酸（dUMP）甲基化形成2′-脱氧胸苷-5′-磷酸（dTMP）,后者进一步在细胞内代谢为脱氧胸苷三磷酸（dTTP）,dTTP为DNA合成所必需的前体物质。它是一种叶酸依赖性酶,是合成DNA所必需的前体物胸腺嘧啶脱氧核苷（dTMP）的关键酶,在细胞增殖中起重要的作用。抑制TS活性能抑制DNA的生物合成,进而抑制肿瘤细胞的增殖和生长。因此,胸苷酸合成酶是肿瘤化学治疗的热门靶点,其抑制剂是抗肿瘤药物研究的重要方向。研究胸苷酸合成酶的三维结构、酶学性质,对研究TS与抑制剂的作用机理及开发新型抑制剂具有重要意义。本课题在人TS cDNA不发生定点突变的情况下,利用一系列分子生物学手段将其与表达载体pET-28b（+）连接得到重组表达载体TS-pET-28b（+）,将重组质粒TS-pET-28b（+）转入到大肠杆菌Transetta（DE3）,鉴定并筛选出阳性转化子TS-pET-28b（+）/Transetta （DE3）,重组大肠杆菌在发酵过程中加入诱导剂IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE鉴别表明表达产物为含有6×His-tag融合标签的重组人类胸苷酸合成酶。为了获得高纯度的、具有天然活性的人TS蛋白,本实验利用重组人类TS蛋白中的6×His-tag融合标签,通过固定金属离子亲和层析Ni-NTA进行特异性纯化,获得了纯度为90%以上的TS蛋白。以纯化得到的重组人TS纯化液为原料,利用氧化-还原转化透析系统对其进行体外复性,复性得率为85.71%,使用操作简单的透析复性方法成功实现了重组人TS的体外复性,获得了具有正常活性的人TS,为进一步研究人TS提供足够的酶来源。以利用氧化-还原转化透析系统进行体外复性后的人TS为原料,通过紫外分光光度法测定酶活力,复性后hTS的酶活力为0.0186U,比活力为0.124U/mg。通过测定已知抑制剂培美曲塞（LY231514）和雷替曲塞（Tomudex）IC50值分别为:5.7×10^-6M、1.0×10^-6M,分析现有hTS抑制剂雷替曲塞,培美曲塞等与酶相互作用后对hTS活性的影响,为分析测定计算机模拟的新型hTS抑制剂对hTS的抑制活性做好前期铺垫。通过文献查阅及实际探索,摸索了重组人TS结晶的条件,本实验确定的最佳实验条件如下,4℃条件下,母液成分组成为:30mM （NH₄）₂SO₄,30%-40%PEG4000,0.2mM Tris-HCl,20mMβ-ME,PH8.5。

人类胸腺核苷酸合成酶结构及其与抑制剂相互作用关系

内容摘要

全文目录

相似论文