学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

鼠疫耶尔森菌质粒缺失株的构建及其致病相关的研究

作　者: 倪斌
导　师: 张彦明
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鼠疫耶尔森菌噬菌体同源重组系统质粒不相容性质粒消除 DNA芯片比较转录谱学毒力致病性
分类号: R378
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
下　载: 179次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

鼠疫(Plague)是一种烈性、细菌性传染病,其流行曾经给人类带来过巨大的灾难。鼠疫的病原为鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)(以下简称鼠疫菌),为肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、耶尔森菌属(Yersinia)成员。主要引发腺鼠疫(bubonic plague)、肺鼠疫(pneumonic plague)和败血症型鼠疫(septicemic plague)3种类型的鼠疫,其中肺鼠疫具有极强的传染性和极高的致死率的特点。链霉素、四环素与氯霉素为治疗鼠疫的首选药物。抗生素的使用,使这种致死性疾病得到了有效控制,但自然疫源地的存在、动物间鼠疫的流行、不断暴发的人间鼠疫、多重耐药株的出现以及日益严峻的生物安全形势,迫使我们不得不重新面对这种古老的疾病。传统生物分型根据硝酸盐还原能力和甘油发酵试验结果,可以将鼠疫菌划分为3种生物型(Biovars):Antiqua(古典)生物型菌株上述两试验均为阳性;Mediaevalis(中世纪)生物型菌株能发酵甘油,但无硝酸盐还原能力;而Orientalis(东方)生物型菌株硝酸盐还原试验阳性,但不发酵甘油。上述生物型分别与人类历史上发生过的3次鼠疫世界大流行——查氏丁尼瘟疫(Justinan plague)、黑死病(Black death)和现代鼠疫(Modern plague)联系在一起。鼠疫菌的致病基因在质粒和染色体上均有分布。鼠疫菌201菌株是一株典型的布氏田鼠疫源地菌株,由本实验室研究提出并被证实为第4种生物型Microtus(田鼠型)鼠疫菌。尽管它具有鼠疫菌强毒株3个已知的质粒(鼠毒素质粒pMT1,低钙反应质粒pCD1和鼠疫菌素质粒pPCP1),并且完全具备4种毒力决定因子(Fra1+、Vwa+、Pgm+和Pst1+),但201菌株具有独特的致病特点:对小鼠表现为强毒型菌株,对于沙土鼠和小家鼠也具有很强的特异性毒力;而对豚鼠、新西兰兔、绵羊以及猕猴等大动物低毒或者完全不致病,对人体也无致病能力。比较基因组学分析发现,201菌株含有一个独特的质粒pCRY,这一质粒长度为21 742 bp,具有独立复制能力,有一群编码IV型分泌系统的基因。而pPCP1质粒与参考菌株基本一致;编码Ⅲ型分泌系统的pCD1质粒编码情况与参考菌株基本相同,但重排导致了质粒的结构与参考菌株存在差异;pMT1质粒保留了较多的原始质粒片段,毒力相关基因与参考菌株没有差异。201菌株的染色体中存在较多的插入序列,发生了IS序列介导的基因组重排事件,导致该菌株染色体的结构与参考菌株存在一些差异。本研究试图从基因组水平,尤其是从质粒方面开展研究,探寻菌株宿主毒力差异的关键所在,证明或排除引发201菌株独特致病性的一些可能因素,来探讨田鼠型鼠疫菌的特异性致病机理。本研究由三部分构成,第一部分建立了鼠疫菌质粒筛选标记技术,利用λ~-Red同源重组系统,以正、反向筛选标记基因来标记鼠疫菌内生质粒,为下一步工作打下基础。第二部分在展开多种常规的理化质粒消除方法对鼠疫菌内源质粒消除未果的情况下,利用质粒不相容性原理,对201菌株4个质粒进行了消除,共得到了15种不同质粒缺失的菌株。第三部分是利用鼠疫菌全基因组DNA芯片,对鼠疫菌质粒消除株进行转录谱研究,为染色体和质粒间相互作用的研究提供了数据。在质粒缺失的基础上,进行了菌株毒力试验研究,获得了以下结果:1.成功建立了鼠疫菌质粒标记,为质粒消除工作的展开提供了极大的便利。2.对Red重组系统的运用条件进行了优化,并进一步改造了同源重组系统,使之能更好的应用于细菌基因组功能的研究。3.建立了鼠疫菌质粒无痕缺失的技术平台,获得了鼠疫菌201菌株4个内生质粒缺失的所有15种组合:(1) pPCP1~- pMT1~+ pCRY~+ pCD1~+; (2) pCD1~- pMT1~+ pCRY~+ pPCP1~+; (3) pCRY~- pMT1~+ pPCP1~+ pCD1~+; (4) pMT1~- pCRY~+ pPCP1~+ pCD1~+; (5) pCD1~- pCRY~- pMT1~+ pPCP1~+; (6) pCD1~- pPCP1~- pMT1~+ pCRY~+; (7) pCD1~- pMT1~- pCRY~+ pPCP1~+; (8) pMT1~- pCRY~- pPCP1~+ pCD1~+; (9) pMT1~- pPCP1~- pCRY~+ pCD1~+; (10) pCRY~- pPCP1~- pMT1~+ pCD1~+; (11) pMT1~- pCRY~- pCD1~- pPCP1~+; (12) pMT1~- pCRY~- pPCP1~- pCD1~+; (13) pMT1~- pPCP1~- pCD1~- pCRY~+; (14) pPCP1~- pCD1~- pCRY~- pMT1~+; (15) pMT1~- pCRY~- pPCP1~- pCD1~-。为田鼠型鼠疫菌特异性致病机理研究以及鼠疫菌质粒功能研究提供了必要的材料。4.质粒清除后的细菌表达谱研究发现,一些参与铁代谢、能量代谢、转运/结合过程的基因转录水平发生了上调或下调,初步证明质粒影响染色体上部分基因功能的发挥。5.当鼠疫菌201菌株缺失不同的质粒后,各质粒缺失株对小鼠的毒力有不同程度的减弱,其中以pCD1质粒和pMT1质粒缺失对菌株毒力的影响最大;研究提示隐蔽型质粒pCRY与鼠疫菌毒力之间存在一定的关系;4个质粒全部消除后,菌株对小鼠不再具有致病性;用该菌株免疫小鼠后具有一定的免疫保护效果。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-14
文献综述  14-49
  第一章鼠疫和鼠疫耶尔森菌的研究进展  14-49
    1.1 鼠疫的研究进展  14-24
      1.1.1 鼠疫概述  14
      1.1.2 鼠疫流行的历史与现状  14-18
      1.1.3 鼠疫的流行病学和病理学症状  18-20
      1.1.4 鼠疫的临床表现、诊断和防治  20-21
      1.1.5 鼠疫疫苗的研制  21-24
    1.2 鼠疫菌的研究进展  24-47
      1.2.1 鼠疫菌病原学  24-26
      1.2.2 鼠疫菌致病机制  26-33
      1.2.3 鼠疫菌的分型  33-43
      1.2.4 鼠疫菌的基因组学研究  43-47
    1.3 本研究的内容、目的和意义  47-49
试验研究  49-111
  第二章鼠疫菌质粒抗性标记的构建  49-61
    2.1 材料  49-51
      2.1.1 菌株和质粒  50
      2.1.2 主要试剂及配制  50-51
      2.1.3 主要仪器  51
    2.2 方法  51-54
      2.2.1 引物的设计  51-52
      2.2.2 pKD46 质粒导入鼠疫菌201 菌株  52
      2.2.3 正向和正、反向筛选功能模块构建  52
      2.2.4 电转化具有重组酶活性的感受态细胞  52
      2.2.5 重组克隆的筛选鉴定  52-53
      2.2.6 重组菌株中pKD46 质粒的驱除  53
      2.2.7 鼠疫菌基因组DNA 的提取  53-54
      2.2.8 PCR 产物的纯化回收  54
    2.3 结果  54-57
      2.3.1 同源重组系统成功转化鼠疫菌201 菌株  54
      2.3.2 正向和正、反向筛选功能模块的获得  54-55
      2.3.3 质粒标记突变株的构建  55-56
      2.3.4 鼠疫菌中pKD46 质粒的无痕消除  56-57
    2.4 讨论  57-61
      2.4.1 电转化相关参数的优化  57-58
      2.4.2 Red 重组系统应用的条件优化  58
      2.4.3 同源臂对Red 重组系统应用的影响  58-59
      2.4.4 改造同源重组系统的运用  59
      2.4.5 基于Red 系统的突变技术在鼠疫菌中的适用性  59-61
  第三章鼠疫菌201 株质粒无痕缺失株的构建  61-88
    3.1 材料  62-63
      3.1.1 菌株和质粒  62
      3.1.2 主要试剂及配制  62-63
      3.1.3 主要仪器  63
    3.2 方法  63-70
      3.2.1 用吖啶类染料进行鼠疫菌质粒消除试验  63-64
      3.2.2 用SDS 对鼠疫菌进行质粒消除  64
      3.2.3 电穿孔法对鼠疫菌进行质粒消除的尝试  64
      3.2.4 改变培养温度条件对鼠疫菌质粒消除的尝试  64-65
      3.2.5 反向筛选法对鼠疫菌质粒消除的可行性研究  65
      3.2.6 基于质粒不相容性原理的质粒消除策略  65
      3.2.7 鼠疫菌201 株质粒模板的制备  65
      3.2.8 鼠疫菌201 株内源质粒复制相关区域（rep）的克隆  65-67
      3.2.9 PCR 产物的回收纯化  67
      3.2.10 PCR 产物和载体DNA 的双酶切处理  67-68
      3.2.11 酶切产物的纯化、回收  68
      3.2.12 酶切产物的连接及后续处理  68
      3.2.13 大肠杆菌感受态细胞的制备  68-69
      3.2.14 转化  69
      3.2.15 抗性克隆的PCR 鉴定  69
      3.2.16 重组质粒的提取  69
      3.2.17 重组质粒的测序鉴定  69
      3.2.18 不相容性重组质粒（pEX18-rep）电转化导入鼠疫菌  69-70
      3.2.19 鼠疫菌质粒缺失株的初步筛选  70
      3.2.20 鼠疫菌质粒缺失株的确证  70
      3.2.21 鼠疫菌中不相容性质粒pEX18-rep 的驱除  70
    3.3 结果  70-83
      3.3.1 吖啶类染料用于鼠疫菌质粒消除  70-72
      3.3.2 SDS 对鼠疫菌进行质粒消除  72
      3.3.3 电穿孔法对鼠疫菌质粒消除的情况  72
      3.3.4 改变培养温度对鼠疫菌质粒消除的尝试  72
      3.3.5 反向筛选法对鼠疫菌质粒消除的研究  72
      3.3.6 鼠疫菌201 株内源质粒复制相关区域的扩增  72-74
      3.3.7 鼠疫菌不相容性质粒的成功构建  74-75
      3.3.8 鼠疫菌质粒缺失株的初筛  75-76
      3.3.9 鼠疫菌质粒缺失株中不相容性质粒驱除后验证  76-78
      3.3.10 鼠疫菌质粒缺失可靠性验证  78-82
      3.3.11 鼠疫菌质粒消除情况  82-83
    3.4 讨论  83-88
      3.4.1 常规理化方法难以消除鼠疫菌内生质粒的原因初探  83-84
      3.4.2 鼠疫菌201 株内源质粒的类型分析  84-85
      3.4.3 质粒pMT1 复制子的特殊性  85
      3.4.4 不相容性质粒与目标质粒在鼠疫菌中共存现象的分析  85-87
      3.4.5 用不相容性消除质粒方法时的体会  87-88
  第四章质粒清除株201Δp 转录谱及质粒缺失株致病性差异的初探  88-111
    4.1 材料  89-90
      4.1.1 菌株和试验动物  89
      4.1.2 主要试剂及配制  89-90
      4.1.3 主要仪器  90
    4.2 方法  90-97
      4.2.1 鼠疫菌全基因组DNA 芯片的研制  90-91
      4.2.2 鼠疫菌全基因组DNA 芯片对质粒清空菌株的验证  91-92
      4.2.3 DNA 芯片转录谱分析的实验方案  92-96
      4.2.4 鼠疫菌质粒缺失株的动物试验  96-97
    4.3 结果  97-105
      4.3.1 鼠疫菌全基因组DNA 芯片对质粒清空菌株的检测结果  97
      4.3.2 鼠疫菌生长曲线的测定  97-99
      4.3.3 DNA 芯片转录谱结果分析  99-104
      4.3.4 鼠疫菌质粒缺失株动物试验结果  104-105
    4.4 讨论  105-111
      4.4.1 DNA 芯片转录谱分析实验的优化设计  105-107
      4.4.2 表达谱结果分析  107-109
      4.4.3 质粒因素引起致病性差异的探讨  109-111
结论  111-112
参考文献  112-123
致谢  123-124
作者简介  124

鼠疫耶尔森菌质粒缺失株的构建及其致病相关的研究

内容摘要

全文目录

相似论文