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XPA蛋白在修复UVB损伤中的作用以及EGCG干预机制的研究

作　者: 林向飞
导　师: 骆丹
学　校: 南京医科大学
专　业: 皮肤性病学
关键词: 中波紫外线(UVB)辐射光损伤与光保护茶多酚胸腺嘧啶二聚体(CPDs) 原代角质形成细胞(原代KC) 着色性干皮病(XP) 基因治疗 HaCaT细胞 XPA慢病毒 NER XPA ERCC1 Westernblotting EGCG
分类号: R751
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

研究背景:目光中的紫外线(UV),主要为长波紫外线(UVA)和中波紫外线(UVB),是导致皮肤日晒伤、光老化及皮肤癌的重要因素。在相同剂量下,UVB的光损伤作用比UVA约大800—1000倍。UVB辐射可导致自由基及活性氧的形成,引起细胞因子产生与分泌,局部及系统免疫抑制,细胞DNA损伤及突变频率增加,甚至导致皮肤光老化及皮肤癌肿的发生。皮肤是抵抗紫外线作用的第一道防线,表皮中的角质形成细胞是中波紫外线(UVB)照射的重要靶位。UVB辐射可引起表皮细胞DNA损伤,产生光产物,主要为6-4光产物((6-4)PPs)和环丁烷嘧啶二聚体(CPDs),这类光产物主要通过核苷酸切除修复(NER)进行切除修复。NER包括:①损伤识别;②损伤部位DNA双链的解螺旋;③损伤部位的双切除;④包含损伤的DNA延伸链的移除;⑤DNA的再合成和连接。XPA、ERCC1、增殖细胞核抗原(PCNA)、复制蛋白A(RPA)、p53等30多种基因产物参与NER过程。XPA蛋白特异性识别紫外线诱导的损伤DNA,启动NER。XPA与RPA或者ERCC1结合。ERCC1多肽对于损伤DNA的NER修复是必需的。在哺乳动物细胞中,XPG切开损伤DNA的3’端,而ERCC1-XPF复合体切开5’端。如果光产物未能及时清除,将导致DNA中出现以C→T或CC→TT碱基置换为特征的突变,突变基因进一步被大量复制,最终将会导致肿瘤发生。着色性干皮病(XP)是一种人常染色体隐性遗传病。XP病人对日光高度敏感,由于紫外线诱导的DNA损伤的修复能力受损导致与紫外线相关的皮肤癌发病率极高。XP共有7个互补型(XP(A-G))和1个变异型(XPV),7个互补型均与NER缺陷有关。DNA损伤在全基因组内的NER修复不是完全相等的。有两种DNA修复途径:1)转录偶联修复,2)全基因组修复。参与这些修复途径的许多因子和XP的发病机理有关。XP的临床处理包括早期诊断然后严格避免各种波长的紫外线辐射,穿紫外线防护衣服,皮肤上外用遮光剂。目前虽然没有治愈XP的方法,但有报道:口服维甲酸可以有效预防新的皮肤癌,局部外用原核DNA修复酶也是有效的方法。提供相关基因有功能的拷贝来治疗人类遗传性疾病是科研的一个热点。XPA基因缺陷是XP患者中最大的组群。因此我们设想:应该可以依据基因治疗原理,采用分子生物学手段,以重组慢病毒作为载体递送人XPA cDNA到XP患者皮肤细胞中,使XP患者皮肤中表达XPA蛋白,恢复其NER功能,从而更加有效治疗XP。中药绿茶提取物茶多酚(tea polyphenols,TP)中的主要活性成分没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechingallate,EGCG)有着广泛的生物学效应,如吸收紫外线、抗过氧化及抗肿瘤等作用。本研究课题组的前期工作已充分证实了EGCG多层次多方面的光生物学效应。本课题旨在研究UVB辐射后原代KC中光产物(CPDs)的产生和清除情况以及EGCG的干预作用;观察XPA蛋白、ERCC1蛋白在紫外线损伤修复中的作用以及EGCG的干预作用;观察编码XPA慢病毒转染的原代KC中XPA蛋白在UVB辐射以及EGCG干预条件下的表达,籍此可为XP疾病提供以基因治疗为目的、根本解决XP基因缺陷问题的新的治疗靶点或途径;同时为天然防晒剂的开发和实际应用提供理论依据和实验数据参考。目的观察EGCG对UVB辐射后HaCaT的保护作用并选择实验浓度;观察UVB辐射后原代KC中光产物CPDs的生成和清除情况以及EGCG对该过程的干预情况;观察UVB辐射后HaCaT细胞和原代KC中NER相关调控分子XPA和ERCC1蛋白的表达以及EGCG的干预作用;观察编码XPA慢病毒转染的原代KC中XPA蛋白的自然表达以及UVB辐射和EGCG干预后的表达情况。方法1 EGCG浓度的选择:以不同浓度的EGCG处理HaCaT细胞,并予UVB辐射,MTT法检测细胞活性后选择EGCG的实验浓度。2细胞培养:以含10%小牛血清的RMPI-1640培养基培养HaCaT细胞(永生化人角质形成细胞株),定量接种于6孔板中或96孔板中。以K-SFM培养基培养人原代KC,定量接种于6孔板中。3紫外线照射:根据实验设计定时定量照射培养细胞并预先或UVB辐射后加入EGCG进行干预处理。4原代KC中光产物生成及清除检测:免疫组织化学法检测胸腺嘧啶二聚体(CPDs)。显微镜下计数阳性细胞。5构建编码XPA慢病毒并转染原代KC:构建XPA过表达慢病毒载体后进行包装并测定滴度,然后转染原代KC。6蛋白表达检测:Western blotting法检测受试各处理条件下的XPA,ERCC1和GAPDH蛋白表达。7统计分析:实验数据用SPSS分析。当P＜0.05时差异有统计学意义。结果1 25-200μg/mL的EGCG均不影响细胞活性,对HaCaT细胞无损伤及毒性作用。UVB辐射可以降低细胞活性,且损伤存在剂量相关性。EGCG可以减少UVB辐射对HaCaT细胞的损伤,在这些浓度中,100和50μg/mL是最佳选择。2原代KC在UVB辐射后4h内对CPDs清除较快,24内清除大部分CPDs。UVB辐射前加入EGCG可以减少CPDs生成,UVB辐射后即刻加入EGCG可加快CPDs清除。3 UVB照射后可明显增加HaCaT细胞和原代KC中XPA和ERCC1蛋白表达水平,EGCG可在不同程度上下调上述蛋白表达。4编码XPA慢病毒可以成功转染原代KC,并且表达XPA蛋白,UVB照射后XPA蛋白表达增加,EGCG可在一定程度上下调XPA蛋白的表达。结论UVB辐射后原代KC对光产物的清除分为两个阶段:开始4h内的快速期和随后至24h的缓慢期。UVB辐射前后加入EGCG可以分别减少光产物生成和加快光产物清除。EGCG可以减轻UVB辐射对细胞的损伤,这种光保护作用可能与其影响NER相关调控分子XPA和ERCC1基因蛋白表达有关。编码XPA慢病毒可以成功转染原代KC并且表达XPA蛋白,此结果为XP的基因治疗提供了初步的实验数据参考。

全文目录

全文技术流程图  4-5
中英文对照及缩略语  5-7
中文摘要  7-12
英文摘要  12-18
全文引言  18-21
论文正文:XPA蛋白在修复UVB损伤中的作用以及EGCG干预机制的研究  21-110
  第一部分 HaCaT细胞的培养和EGCG实验浓度的选择  21-30
    材料与方法  21-24
    结果  24-27
    讨论  27-28
    参考文献  28-30
  第二部分 EGCG对UVB辐射后原代KC中光产物产生和清除影响的研究  30-47
    材料与方法  30-36
    结果  36-43
    讨论  43-45
    参考文献  45-47
  第三部分 XPA蛋白和ERCC1蛋白在紫外线损伤修复中的作用以及EGCG的干预作用  47-73
    第一节 UVB辐射对HaCaT细胞中XPA和ERCC1蛋白的影响和EGCG的干预作用  48-60
      材料与方法  48-56
      结果  56-60
    第二节 UVB辐射对原代KC中XPA和ERCC1蛋白的影响和EGCG的干预作用  60-65
      材料与方法  60-61
      结果  61-65
    讨论  65-69
    参考文献  69-73
  第四部分编码XPA慢病毒转染的原代KC中XPA蛋白的表达以及EGCG的干预作用  73-110
    第一节 XPA慢病毒载体的构建和包装及滴度测定  74-99
      第一部分目的基因(pGC-E3-XPA)慢病毒载体构建  74-85
        1 实验材料  74-75
        2 实验流程  75-76
        3 真核表达载体的线性化  76-78
        4 PCR获得目的基因片段  78-80
        5 重组克隆制备  80-82
        6 阳性克隆的PCR鉴定  82-84
        7 阳性克隆测序结果及结果分析  84-85
      第二部分目的基因(pGC-E3-XPA)慢病毒包装及滴度测定  85-99
        1 实验材料  85-87
        2 实验流程  87-95
        3 实验结果  95-99
    第二节 XPA慢病毒转染的原代KC中XPA蛋白的表达和EGCG的干预作用  99-104
      材料与方法  99-102
      实验结果  102-104
    讨论  104-107
    参考文献  107-110
全文小结  110-112
附综述和已发表文章  112-113
致谢  113-114

XPA蛋白在修复UVB损伤中的作用以及EGCG干预机制的研究

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