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骨髓间充质干细胞促进脐血CD34+细胞体外扩增、体内植入以及重组逆转录病毒载体和HOXB4高表达的实验研究

作　者: 费小明
导　师: 汪承亚
学　校: 南京医科大学
专　业: 内科
关键词: 脐血 CD34+细胞 扩增 骨髓间充质干细胞 逆转录病毒 载体 HOXB4 绿色荧光蛋白 潮霉素 NOD/SCID 白血病 K562 移植 GFP
分类号: R329.2
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


目的研究人骨髓间充质干细胞(MSC)对脐血CD34+细胞体外扩增的促进作用，以及扩增后脐血细胞植入NOD／SCID小鼠的能力。方法分离、培养正常人的骨髓MSC。用培养至第3代的MSC作为饲养层细胞，联合血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、flt3／flk2配体(FL)和粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)扩增脐血CD34+细胞。比较有或无MSC饲养层细胞条件下，脐血CD34+细胞经1或2周的体外扩增后，总细胞(TC)、CD34+细胞和集落形成单位(CFU)数的增加倍数。并分别将扩增前、后脐血细胞移植非肥胖性糖尿病／重症联合免疫缺陷(NOD／SCID)小鼠，比较扩增和非扩增脐血细胞重建受鼠造血的能力。结果成功分离和培养人骨髓MSC。脐血CD34+细胞按1×10~4／ml密度接种后，在单纯细胞因子刺激条件下体外扩增1周后，总有核细胞(TNC)，总CFU数、粒-单核细胞集落形成单位(CFU-GM)数、暴式红细胞形成单位(BFU-E)数和CD34+细胞数的均值分别较扩增前增加了17、9、7、4和4倍(n=6)；扩增2周后，TNC、总CFU数、CFU-GM数、BFU-E数和CD34+细胞数的均值分别较扩增前增加了156、71、25、36和7倍(n=6)。在脐血CD34+细胞的扩增中加入骨髓MSC作为饲养层细胞，比单纯用细胞因子刺激更加有效地扩增脐血细胞。体外扩增1周后，TNC、总CFU数、CFU-GM数、BFU-E数和CD34+细胞数的均值分别较扩增前增加了25、19、19、10和11倍；体外扩增2周后，TNC、总CFU数、CFU-GM数、BFU-E数和CD34+细胞数的均值分别较扩增前增加了449、351、325、93和41倍。将非扩增或扩增2周的脐血细胞从尾静脉输入亚致死量照射的NOD／SCID小鼠6周后，分别检测受鼠骨髓内人源细胞的比例。移植未扩增脐血细胞的对照组小鼠骨髓中CD45+细胞比例仅为1.2～3.7％；移植单纯细胞因子刺激扩增脐血小鼠骨髓内CD45+细胞比例为7.6～12.1％；以MSC为饲养层扩增的脐血细胞移植小鼠后，受鼠骨髓内CD45+细胞比例达到45.3～59.1％。结论用人骨髓MSC为作为脐血CD34+细胞体外扩增的饲养层细胞，联合细胞因子FL、TPO、SCF和G-CSF，不但可以更加有效地扩增TNC、CFU和CD34+细胞，而且扩增后脐血细胞移植NOD／SCID小鼠后，可以促进脐血细胞在受鼠体内的短期植入，有利于加速扩增后脐血细胞移植NOD／SCID造血重建。人骨髓MSC为作为饲养层细胞扩增脐血细胞的方法有潜在的临床应用价值。目的建立的HOXB4重组逆转录病毒的生产、浓缩和感染体系。并检测重组逆病毒感染k562细胞的HOXB4表达水平。方法用质粒pCMV-G和pCMV-GP协同转染包装细胞293T-HOX，收集病毒上清液(VCM)。并将VCM高速离心浓缩提高病毒的滴度。采用定量PCR和western blot检测重组HOXB4逆转录病毒感染K562细胞中同源盒基因的表达水平。结果通过用用质粒pCMV-G和pCMV-GP协同转染包装细胞293T-HOX的方法，可以获得含较高病毒滴度的VCM。所得的VCM经高速离心机离心后，具有可以接受的病毒回收率，并且病毒的滴度也大幅提高。用所收获的VCM感染白血病细胞株K562细胞后，用定量PCR和western blot检测均发现感染细胞中HOXB4的表达水平增高。结论成功建立的HOXB4重组逆转录病毒的生产、离心浓缩和感染体系；为今后HOXB4基因对造血干细胞生物学特性及移植影响的研究建立了一个平台。目的构建含增强绿色荧光蛋白(EGFP)和潮霉素抗性(Hyg)的重组逆转录病毒载体。方法依次将Hyg抗性和EGFP基因片段，插入逆病毒空载体质粒pCMV-LL-SA-2中，构建重组的逆病毒载体质粒pCMV-GFP-hyg。然后将其与质粒pCMV-G和pCMV-GP共转染293T细胞，产生含有目的基因的重组逆病毒。结果获得的重组逆转录病毒载体，经限制性内切酶鉴定，提示其为目的载体质粒pCMV-GFP-hyg。转染该质粒的293T细胞表达绿色荧光蛋白。重组逆病毒载体质粒pCMV-GFP-hyg与质粒pCMV-G和pCMV-GP共转染293T细胞后24和48小时，收集病毒上清液(VCM)，用NIH 3T3细胞检测重组逆病毒滴度，转染后24和48小时VCM的滴度分别为7.5 x10~5CFU／ml和1.5×10~6CFU／ml。结论成功构建了表达EGFP和Hyg抗性的重组逆转录病毒载体；转染293T细胞后可以产生较高滴度的VCM。目的建立绿色荧光蛋白(GFP)标记的人白血病细胞株K562，并以此移植非肥胖型尿病／重症联合免疫缺陷(NOD／SCID)小鼠，建立白血病研究的动物模型。方法用含GFP和潮霉素抗性基因的重组逆病毒载体感染人白血病细胞株K562，经潮霉素筛选后得到均一、具有荧光标记的K562(K562-GFP)细胞。应用NOD／SCID小鼠作为实验动物，经2.5Gy的γ射线照射后，从尾静脉注射5×10~5个K562-GFP细胞(n=3；第1组)；或1×10~6个K562-GFP细胞(n=3；第2组)；或生理盐水作为对照组(n=1)。移植后第6周用流式细胞术(FCM)和PCR检测受鼠体内白血病细胞。结果GFP可以在K562细胞中稳定表达。NOD／SCID小鼠移植K562-GFP细胞6周后FCM检测，受鼠骨髓中CD45+标记的人源细胞比例均数分别为12.3％(第1组)和22.6％(第2组)，这些细胞同时具有自身荧光标记。并且受鼠外周血和脾脏也可检测到K562白血病细胞。结论K562-GFP细胞移植NOD／SCID小鼠，成功建立了白血病动物模型，为白血病的相关研究提供了动物模型平台。

全文目录


第一章 人骨髓间充质干细胞促进脐血CD34+细胞的体外扩增和植入非肥胖性糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠  3-39
  摘要  3-4
  Abstract  4-6
  前言  6-8
  材料和方法  8-17
  结果  17-30
  讨论  30-36
  参考文献  36-39
第二章 重组逆转录病毒的构建和目的基因高表达的研究  39-115
  第一节 制备重组HOXB4逆转录病毒及HOXB4高表达的实验研究  39-78
    摘要  39-40
    Abstract  40-41
    前言  41-42
    材料和方法  42-59
    结果  59-71
    讨论  71-75
    参考文献  75-78
  第二节 含绿色荧光蛋白(GFP)和潮霉素抗性基因重组逆转录病毒载体的构建  78-115
    摘要  78-79
    Abstract  79-80
    前言  80
    材料、方法和结果  80-112
    讨论  112-113
    参考文献  113-115
第三章 应用K562-GFP细胞建立NOD/SCID小鼠人白血病模型的实验研究  115-135
  摘要  115-116
  Abstract  116-117
  前言  117-118
  材料和方法  118-124
  结果  124-129
  讨论  129-133
  参考文献  133-135
附录  135-136
致谢  136-138
综述及参考文献  138-153

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学 > 人体细胞学
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