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RNA干扰沉默TREM-1对脆弱类杆菌脂多糖炎症反应的抑制作用及其机制研究

作　者: 闵安杰
导　师: 黄晓元
学　校: 中南大学
专　业: 外科学
关键词: 髓系细胞触发受体-1 脆弱类杆菌脂多糖炎症反应 RNA干扰短发夹状RNA 电转染促炎症因子信号转导 DAP12
分类号: R346
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

第一章TREM-1在脆弱类杆菌脂多糖炎症反应中的表达目的探讨在脆弱类杆菌脂多糖所诱导THP-1与HL-60细胞炎症反应中TREM-1的表达情况及其与促炎症因子分泌的关系。方法厌氧分离培养脆弱类杆菌临床株，改良热酚水法提取细菌脂多糖，以脆弱类杆菌脂多糖刺激分化后的单核细胞株THP-1和粒细胞株HL-60，半定量RT-PCR法检测TREM-1 mRNA的表达，Western blot法检测TREM-1蛋白的表达，并用ELISA法检测THP-1细胞上清中TNF-α、IL-1β与HL-60细胞上清中IL-6、IL-8的含量。结果在脆弱类杆菌脂多糖刺激下，分化后的THP-1与HL-60细胞中TREM-1表达水平皆明显上调，并呈时间依赖性，分别于8h(THP-1)和12h(HL-60)达高峰；而不同浓度的脆弱类杆菌脂多糖对TREM-1的诱导作用呈剂量依赖性，以1μg／ml脂多糖的诱导效应最明显；同时伴有TNF-α、IL-1β(THP-1)及IL-6、IL-8(HL-60)的大量分泌，并分别与TREM-1蛋白表达水平呈正相关(r_s=0.82，0.85及0.83，0.88，P＜0.01)。结论TREM-1表达水平在脆弱类杆菌脂多糖的诱导下呈时间—剂量依赖性增高，并可能对促炎症因子的分泌起一定作用。构建的脆弱类杆菌脂多糖炎症反应细胞模型为后续研究提供了实验平台。第二章TREM-1靶向性shRNA对脆弱类杆菌脂多糖炎症反应的抑制作用目的研究通过RNA干扰技术使TREM-1基因沉默后对脆弱类杆菌脂多糖炎症反应的影响。方法体外转录法合成针对TREM-1 mRNA的shRNA，电穿孔法瞬时转染入分化后的THP-1与HL-60细胞，继予1μg／ml脆弱类杆菌脂多糖分别刺激8h与12h，于转染后48h通过半定量RT-PCR法检测TREM-1 mRNA的表达，Western blot法检测TREM-1蛋白的表达，并用ELISA法检测THP-1细胞上清中促炎症因子TNF-α、IL-1β与HL-60细胞上清中促炎症因子IL-6、IL-8含量的变化。结果转染shRNA后TREM-1 mRNA及蛋白表达均有明显下调，其中以shRNA-2干扰效果最为明显。同时，转染shRNA使THP-1细胞上清中TNF-α，IL-1β的含量与HL-60细胞上清中IL-6、IL-8的含量明显降低。而对照组无类似效果。结论电转染体外转录合成的shRNA可选择性抑制TREM-1表达，下调脆弱类杆菌脂多糖诱导的促炎症因子的分泌，对炎症反应具有抑制作用。第三章RNA干扰沉默TREM-1对脆弱类杆菌脂多糖炎症反应抑制作用的机制目的探讨RNA干扰沉默TREM-1对脆弱类杆菌脂多糖炎症反应产生抑制作用的机制。方法电转染TREM-1 shRNA-2或shRNA-NC入分化后的THP-1与HL-60细胞并予以脆弱类杆菌脂多糖刺激，Western blot法测定各组细胞中DAPl2、NF-κB p65、IκBα蛋白表达水平，RT-PCR法检测THP-1细胞中TNF-α、IL-1βmRNA及与HL-60细胞中IL-6、IL-8 mRNA表达水平。结果TREM-1 shRNA-2转染能明显下调脆弱类杆菌脂多糖作用下THP-1与HL-60细胞中DAP12、NF-κB p65蛋白的表达水平和上调IκBα蛋白的表达水平，并降低TNF-α、IL-1β及IL-6、IL-8 mRNA的表达水平，而shRNA-NC无此作用。结论TREM-1 shRNA转染可能通过下调THP-1与HL-60细胞中DAP12的表达，稳定IκBα／NF-κB复合物，抑制TNF-α、IL-1β及IL-6、IL-8基因的转录，而对脆弱类杆菌脂多糖炎症反应产生抑制作用。

全文目录

中文摘要  5-8
英文摘要  8-14
英文缩略词  14-16
前言  16-19
第一章 TREM-1在脆弱类杆菌脂多糖炎症反应中的表达  19-47
  1.1 材料与方法  19-33
  1.2 结果  33-42
  1.3 讨论  42-46
  1.4 小结  46-47
第二章 TREM-1靶向性shRNA对脆弱类杆菌脂多糖炎症反应的抑制作用  47-67
  2.1 材料与方法  47-55
  2.2 结果  55-60
  2.3 讨论  60-66
  2.4 小结  66-67
第三章 RNA干扰沉默TREM-1对脆弱类杆菌脂多糖炎症反应抑制作用的机制  67-78
  3.1 材料与方法  67-70
  3.2 结果  70-75
  3.3 讨论  75-77
  3.4 小结  77-78
全文结论  78-79
参考文献  79-89
综述  89-102
  TREM-1及其受体家族研究进展  89-102
致谢  102-103
攻读博士学位期间发表论文  103

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