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目的:基于“肾藏精,主骨生髓”的理论,本实验采取去卵巢造模方法建立大鼠绝经后骨质疏松症(PMOP)模型,以肾虚为PMOP的主要发病原因出发,研究左归丸对PMOP大鼠的防治作用,并从TGF-β/Smad信号转导途径探讨左归丸防治PMOP大鼠的作用机制。材料与方法:选取91只SPF级4.5月龄SD雌性大鼠,按体重随机分层,每层按数量比暂分为三组:正常(Normal)组13只;假手术(Sham)组13只;其余65只采取双侧背部卵巢切除术进行PMOP造模。造模21d后,将去卵巢大鼠按体重随机分为五组:模型空白(OVX)组、尼尔雌醇(N)组、左归丸高剂量[ZG(H)]组、左归丸中剂量[ZG(M)]组、左归丸低剂量[ZG(L)]组,每组均为13只。然后开始灌胃给药:左归丸各剂量组用左归丸混悬液(高、中、低)进行灌胃;尼尔雌醇组为阳性对照组,灌服尼尔雌醇混悬液;正常组、假手术组和模型空白组均灌服蒸馏水,灌胃期间,各组大鼠每周称重1次,并根据体重调整给药量。实验大鼠连续给药120d后取材,截止取材时,除去灌胃期间死亡的大鼠,取材大鼠共82只。取材前禁食禁水24h,大鼠经腹主动脉取血,室温静置2h后,4℃,3500r·min-1离心30min,取血清,分装,于-70℃冰箱保存,除去溶血血清,用于骨代谢指标及性腺激素水平检测的血清,每组大鼠均为8只;取大鼠左后肢股骨远端1/3,剔除软组织及筋膜,置于4%的多聚甲醛固定液中固定保存,用于病理形态学测定;取大鼠左后肢股骨近端1/3部分,剔除软组织及筋膜,用DEPC水处理过的铝箔纸包裹好,做好标记,迅速置入液氮中速冻,之后放入-70℃冰箱保存,以备RT-PCR方法检测骨组织中TGF-β1、Smad4m RNA的表达;取大鼠右后肢股骨,剔除骨组织上附着的肌肉筋膜,保留骨膜,生理盐水冲洗后,用盐水浸湿过的纱布将其包好,放入保鲜袋中,置-20℃冰箱冻存,用于骨密度(BMD)的检测。结果:1、左归丸对骨组织形态计量学参数的影响(1)骨组织形态学检测光镜下观察,正常组、假手术组大鼠骨小梁完整,连接紧密,有规则,相互之间成网状,骨髓腔较小;模型空白组大鼠骨小梁较紊乱,变细,缺少连接,可见到骨小梁断端。左归丸组(高、中、低)及尼尔雌醇组骨小梁有较显著的增生,骨小梁排列整齐,较粗壮,以尼尔雌醇组和左归丸高剂量组较为显著。(2)骨组织形态计量学测定模型空白组大鼠与假手术组比较,骨小梁面积百分比(%Tb·Ar)、骨小梁厚度(Tb·Th)明显降低,骨小梁分离度(Tb·Sp)明显升高,差异显著(P<0.01);去卵巢大鼠灌服左归丸及尼尔雌醇后,与模型空白组比较,左归丸高、中、低剂量组及尼尔雌醇组大鼠的%Tb·Ar、Tb·Th明显升高,Tb·Sp明显降低,差异显著(P<0.01);各用药组之间无显著性差异(P>0.05)。2、左归丸对去卵巢大鼠离体股骨近端1/3骨密度的影响模型空白组大鼠与假手术组相比,离体股骨近端骨密度显著下降(P<0.01);去卵巢大鼠灌服左归丸及尼尔雌醇后,与模型空白组比较,左归丸高、中、低剂量组及尼尔雌醇组大鼠离体股骨近端骨密度显著升高(P<0.01),各用药组之间无显著性差异(P>0.05)。3、左归丸对骨代谢指标的影响(1)左归丸对骨形成指标血清BGP的影响模型空白组大鼠与假手术组相比,血清BGP含量显著升高(P<0.01);去卵巢大鼠灌服左归丸及尼尔雌醇后,与模型空白组比较,左归丸高、中、低剂量组及尼尔雌醇组大鼠血清BGP含量显著下降(P<0.01),其中以左归丸高、中剂量组的下降趋势较强,各用药组之间无显著性差异(P>0.05)。(2)左归丸对骨吸收指标血清TRAP的影响模型空白组大鼠与假手术组相比,血清TRAP含量显著升高(P<0.01);去卵巢大鼠灌服左归丸及尼尔雌醇后,与模型空白组比较,左归丸高、中、低剂量组及尼尔雌醇组大鼠血清TRAP含量显著下降(P<0.01),各用药组之间无显著性差异(P>0.05)。4、左归丸对血清性腺激素的影响模型空白组大鼠与假手术组相比,血清雌二醇(E2)明显下降(P<0.01),促卵泡生成素(FSH)、促黄体生成素(LH)明显升高(P<0.01);灌服左归丸各剂量后, E2水平升高(P<0.05),而FSH、LH明显下降(P<0.05),各用药组之间无显著性差异。5、左归丸对骨组织中TGF-β1、Smad4 mRNA表达的影响去卵巢后,与假手术组比,模型空白组大鼠骨组织中TGF-β1、Smad4 mRNA水平明显降低(P<0.01);灌服左归丸各剂量组后,骨组织中TGF-β1、Smad4 mRNA水平显著上升(P<0.01),各用药组之间无显著性差异(P>0.05)。结论:1、切除大鼠双侧卵巢可成功复制PMOP模型。2、左归丸可以有效防治PMOP。3、骨组织中TGF-β1、Smad4 mRNA表达水平的下调可能是PMOP发生的重要机制之一。4、左归丸能够上调骨组织中TGF-β1、Smad4 mRNA的表达,纠正PMOP骨代谢失衡,其防治PMOP的作用机制可能与其干预TGF-β1、Smad4 mRNA的表达有关。
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