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CD59-CD2融合蛋白真核表达载体的构建及对T细胞信号转导的作用研究

作　者: 钟丹丹
导　师: 高美华
学　校: 青岛大学
专　业: 免疫学
关键词: CD59基因 CD2基因 融合基因 Jurkat细胞 细胞信号转导
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的：构建CD59-linker-CD2融合基因真核表达载体并在Jurkat细胞中稳定表达,研究CD59与CD2分子在T细胞信号转导中的相互作用,探讨CD59向T细胞内传递信号的相关机制。方法：从人T细胞白血.病细胞系Jurkat细胞中提取总RNA,利用RT-PCR法扩增CD59和CD2基因,分别构建CD59-T和CD2-T重组克隆载体,经限制性核酸内切酶酶切后与pTRES质粒进行重组,构建pIRES-CD59-linker-CD2融合基因真核表达载体；脂质体法转染Jurkat细胞,G418筛选建立稳定转染细胞系,免疫酶法检测转染细胞表面CD59的表达,RT-PCR检测转染细胞中CD59 mRNA表达量的变化,Western Blot检测转染细胞中CD59蛋白的表达；用CD59单克隆抗体作用于各组Jurkat细胞,Western Blot检测细胞内的ZAP70磷酸化的水平,ELISA检测细胞上清中IL-2的变化,比较各组差异。结果：经限制性核酸内切嗨酶切、PCR和测序鉴定表明携带CD59-1inker-CD2融合基因的重组质粒构建成功；免疫酶法和RT-PCR试验证实CD59在转染细胞L-Jurkat中高表达,Western Blot表明L-Jurkat细胞比正常Jurkat细胞CD59蛋白表达量增加,二者比较其差别有统计学意义(P<0.05)；与正常细胞相比,磷酸化的ZAP70和IL-2在转染细胞中均高表达,二者比较其差别有统计学意义(P<0.05)。结论：pIRES-CD59-linker-CD2融合基因真核表达载体可在Jurkat细胞中稳定表达,CD59mAb交联后,CD59可通过CD2的胞内段向T细胞内传递信号,引起细胞内信号分子的一系列变化,为研究CD59与CD2在T细胞信号转导中的协同作用及进一步探讨CD59此类锚固蛋白向T细胞内传递信号的机制奠定基础。

全文目录


摘要  2-3
Abstract  3-6
引言  6-8
技术路线  8-9
第一章 材料与方法  9-25
  1.1 材料  9-10
    1.1.1 主要仪器设备  9
    1.1.2 质粒、菌株与细胞株  9
    1.1.3 主要实验试剂  9-10
  1.2 方法  10-25
    1.2.1 pIRES-CD59-linker-CD2重组质粒的构建  10-19
      1.2.1.1 PCR扩增引物的设计  10-11
      1.2.1.2 Jurkat细胞的培养  11
      1.2.1.3 Jurkat细胞内总RNA的提取  11
      1.2.1.4 目的基因的扩增  11-12
      1.2.1.5 CD59-T和CD2-T重组克隆载体的构建及鉴定  12-16
      1.2.1.6 CD59-pIRES重组表达载体的构建及鉴定  16-17
      1.2.1.7 pIRES-CD59-linker-CD2表达载体的构建及鉴定  17-19
    1.2.2 Jurkat细胞的转染及稳定转染细胞克隆的筛选  19-23
      1.2.2.1 Jurkat细胞的培养  19
      1.2.2.2 Jurkat细胞的转染  19-20
      1.2.2.3 稳定转染细胞克隆的建立  20
      1.2.2.4 稳定转染细胞阳性克隆的鉴定  20-23
    1.2.3 功能检测  23-24
      1.2.3.1 ZAP-70的Western Blot检测  23
      1.2.3.2 ELISA定量检测人白介素2(IL-2)  23-24
    1.2.4 统计学分析  24-25
第二章 实验结果  25-33
  2.1 pIRES-CD59-linker-CD2重组质粒的构建  25-27
    2.1.1 CD59和CD2片段的扩增  25
    2.1.2 CD59-T克隆载体的PCR及酶切鉴定  25-26
    2.1.3 CD2-T克隆载体的PCR及酶切鉴定  26
    2.1.4 阳性重组质粒pIRES-CD59-linker-CD2的PCR及酶切鉴定  26-27
    2.1.5 阳性重组质粒的测序结果  27
  2.2 重组质粒转染Jurkat细胞的筛选及鉴定  27-30
    2.2.1 Jurkat细胞的复苏与培养  27
    2.2.2 G418筛选稳定转染的阳性细胞克隆  27-28
    2.2.3 稳定转染细胞阳性克隆的鉴定  28-30
  2.3 功能检测结果  30-33
    2.3.1 ZAP-70的Western Blot检测  30-31
    2.3.3 Jurkat细胞IL-2表达水平的变化  31-33
第三章 讨论  33-37
结论  37-38
参考文献  38-40
综述  40-50
  综述的参考文献  46-50
攻读学位期间的研究成果  50-51
附录  51-58
  附录1 试剂的配制  51-55
  附录2 CD59 cDNA序列  55-56
  附录3 阳性重组质粒的测序图  56-58
致谢  58-59

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学 > 免疫生物学
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