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基于乙酰化稳定同位素标记—液相色谱—傅立叶变换离子回旋共振质谱联用的定量蛋白质组研究策略的建立、评价与应用

作　者: 刘新
导　师: 钱小红；应万涛
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药物分析学
关键词: 定量蛋白质组胍基化乙酰化稳定同位素标记傅立叶变换离子回旋共振质谱仪 MSAQ N末端肽 CYP45O定量蛋白质组血浆定量蛋白质组
分类号: R817
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

蛋白质组学研究已从静态的定性分析逐步过渡到动态变化的定量研究。为了实现蛋白质组学的定量分析，各种定量方法相继被开发，例如基于双向凝胶电泳的定量技术，基于非标记的定量技术，基于质量标签的定量技术，基于液质联用的稳定同位素标记定量技术等多类定量策略。由于基于液质联用的稳定同位素标记技术在定量的准确度，适用范围等方面都超过了前三类定量方法，因而被广泛采用，其商业化的试剂不断被推出。但是由于商业化的标记方法普遍存在试剂昂贵（iTRAQ），标记位点少（ICAT），只能用指定的质谱仪进行数据采集（依赖性强），分析软件只能用于商业公司自身的质谱仪（通用性差）等缺陷，其应用范围受到限制。本研究目的是开发一整套具有自主知识产权的基于稳定同位素标记和液质联用的蛋白质组学定量新策略，实现高通量，高准确性，高灵敏度的蛋白质组学定量分析，用来克服商业化试剂存在的不足，摆脱对于商业化标记试剂的依赖性。本研究首先建立和优化了一种针对肽段还原性氨基的乙酰化稳定同位素标记方法。该方法经条件优化后具有以下优点：乙酰化稳定同位素试剂用量少，副反应少，能标记样品中全部蛋白质或肽段，标记后的蛋白质或肽段的质量差可以预测，标记方法简单，标记过程反应条件温和，标记基团在多维色谱分离条件中稳定，标记基团在质谱分析中稳定，不会产生额外的碎片离子，标记方法能够应用于包括人体在内的所有生物样本并且试剂廉价易得。但是单纯的乙酰化标记方法标记位点是还原性的氨基端，每个肽段至少标记上一个乙酰基团（即至少掺入3个氘原子），尽管氘原子数量的增加可以避免标记肽段间同位素峰重叠问题，但是随着掺入的氘原子数量的增加而引起的反相色谱中的同位素效应也会增加。为了减少由于同位素效应引起的标记肽段色谱保留时间滞后，从而造成质谱分析的误差，构建了基于纳升级反相色谱分离、在线点靶和MALDI—TOF／TOF—MS质谱仪联用的定量策略。通过标准蛋白质混合物的定量实验验证，表明该策略完全可以实现准确定量分析，具有实际应用价值。在规模化蛋白质鉴定分析中，电喷雾离子源（ESI）质谱和基质辅助激光解析电离源（MALDI）质谱相比，前者使用更为广泛。因此，为了能够将乙酰化标记方法与在线色谱分离和纳升级电喷雾离子源的傅立叶变换离子回旋共振质谱仪联用，同时提高乙酰化标记方法的质谱检测灵敏度，本研究又发展了一种胍基化修饰乙酰化稳定同位素标记方法。该方法除了具有上述乙酰化标记方法的优点之外，由于胍基化修饰的乙酰化的标记方法保证了每个肽段只会被一个乙酰基所标记（即只有3个氘原子的掺入），因此很好的控制了氢氘同位素试剂在反相色谱中的同位素效应，同时提高了标记肽段在质谱中的灵敏度。通过标准蛋白质混合物体系的定量分析实验，表明该策略定量分析准确，可重复性强。在胍基化修饰的乙酰化标记方法建立的基础上，我们根据标记方法和所使用的傅立叶变换离子回旋共振质谱仪数据采集的特点，自主开发了一套自动化数据定量分析软件MSAQ，用于规模化的定量计算。为了进一步评价本研究中建立的基于胍基化修饰的乙酰化稳定同位素标记，液相色谱—傅立叶变换离子回旋共振质谱和自主开发的定量分析软件MSAQ联用的定量蛋白质组策略在生物样本中应用的可行性，我们将该策略在三种不同的复杂生物样本体系中进行了实际应用，获得了满意的结果。首先，我们将该策略应用于大肠杆菌N末端肽组学研究中。在整体蛋白质水平胍基化后的氢代氘代乙酰化标记，既提高了肽段在质谱中检测灵敏度，又实现了对蛋白质N末端肽的特异性同位素标记，因而易于从一级质谱图中识别N末端肽同时进行串联质谱测序分析。77种大肠杆菌蛋白质的N—末端序列被确定，其中46种蛋白质N—末端序列信息和Swiss-Prot数据库完全一致，另外31种蛋白质的甲硫氨酸是否去除的信息在数据库中没有详细注释，而通过我们实验对该31种蛋白质甲硫氨酸是否去除进行了精确测定，另外确证了9种蛋白质的N末端是以信号肽去除的方式存在。实验结果表明，本研究建立的定量蛋白质组策略不仅能对蛋白质的N末端进行规模化的特异性识别和测序，还能对N末端的翻译后修饰（如甲酰甲硫氨酸和信号肽去除问题）进行精确测定。该策略与传统的Edman降解具有灵敏度高、特异性强和通量化的优点，因而在蛋白质N末端测序领域有着更加广泛的应用前景。其次，我们将该策略应用于代谢蛋白质组学研究中。对由四氯化碳（CCl₄）造成的大鼠肝损伤组织CYP450蛋白质表达量进行了定量研究，17种CYP450蛋白质被定量分析，其中2E1的表达量显著下调，该结果验证了由于2E1介导的CCl₄的代谢产生活泼的自由基，从而导致2E1蛋白比之其他CYP450蛋白质更容易受到CCl₄毒理性的影响的论断。同时除了2E1表达量显著变化外，其他几种CYP450蛋白质表达量同时也发生了显著性的变化，说明本研究中所使用的规模化的定量分析手段，不仅可以对于已有研究结果进行确认，同时还可以揭示其他CYP450蛋白质表达量的变化。最后，我们将该策略应用于血浆定量蛋白质组学研究。血浆蛋白质组成与细胞、组织与器官的生理病理状态密切相关。由于血浆蛋白质含量动态范围非常宽(＞10¹²)，因而，如果能够对血浆蛋白质进行高通量化、高准确度和高灵敏度的定量分析，是对本研究中所建立的整套定量分析策略最好的评价。（1）我们对正常血浆样本进行了1：1标记实验，结果显示理论值和实验值的误差小于5％。（2）对处于肝炎不同阶段的血浆样本进行了定量研究，总共对1025种血浆蛋白质进行了定量分析，其中具有2倍以上显著性差异的蛋白质有185种。包括了在血浆中浓度只有20ng／ml的Heparin cofactor 2 precursor，和浓度小于10pg／ml Angiotensinogen precursor，该结果表明本标记方法实现了动态范围达9个数量级的血浆蛋白质定量分析（albumin，35mg／mL-Angiotensinogen precursor，＜10pg／mL）。（3）为了进一步验证定量结果的可靠性，对其中一种差异显著的蛋白质Fibronectin进行了western验证。分析显示western定量结果和质谱定量结果一致。综上所述，本研究建立的基于胍基化乙酰化稳定同位素标记，液相色谱—傅立叶变换离子回旋共振质谱和自主开发的定量分析软件MSAQ联用的定量蛋白质组学新策略，既能够对来自于原核生物的样本进行分析，又能够对来自真核生物的样本进行分析，既能够分析组织样本又能够分析体液样本。在对上述三个复杂生物体系蛋白质表达的定量分析中，从多维分离系统角度研究表明，无论对基于一维SDS—PAGE凝胶的蛋白质分离还是对基于液相色谱系统的蛋白质分离，本研究中所使用的定量策略都具有很好的兼容性；从定量结果角度研究表明，本研究中所使用的定量策略满足了高通量化，高准确度，高灵敏度和高自动化的定量蛋白质组学研究需求。证明该定量策略在蛋白质组学研究中将具有广阔的应用前景!

全文目录

中文摘要  9-13
英文摘要  13-17
缩略语索引  17-18
第一章前言  18-41
  1.蛋白质组学研究中的定量分析方法  19-31
    1.1 基于二维凝胶电泳(2-DE)的定量蛋白质组学技术  19-21
    1.2 基于蛋白质芯片技术的蛋白质组定量分析方法  21-22
    1.3 基于非标记策略的蛋白质组定量方法  22-23
    1.4 基于稳定同位素标记的蛋白质组定量分析方法  23-30
    1.5 非稳定同位素标记的质量丰度标签技术  30
    1.6 定量蛋白质组分析软件  30-31
    1.7 展望  31
  2.本文研究工作  31-33
  参考文献  33-41
第二章乙酰化稳定同位素标记方法的建立与优化  41-66
  1.材料与方法  42-46
    1.1 仪器与试剂  42-43
    1.2 实验方法  43-46
  2.结果与讨论  46-61
    2.1 乙酰化标记的基本原理  46
    2.2 乙酰化标记反应条件优化  46-61
      2.2.1 不同缓冲体系对乙酰化反应效率的影响  46-48
      2.2.2 乙酰化试剂用量对乙酰化效率的影响  48-50
      2.2.3 pH值对乙酰化效率的影响  50-51
      2.2.4 温度对乙酰化效率的影响  51
      2.2.5 反应时间对乙酰化效率的影响  51-52
      2.2.6 乙酰化位点的确定  52-54
      2.2.7 乙酰化标记反应中形成的酯键及其去除效果的考察  54-56
      2.2.8 乙酰化稳定同位素标记马心肌红蛋白酶切肽段的动态范围考察  56-58
      2.2.9 乙酰化标记对肽段在MALDI源质谱离子化效率的影响  58
      2.2.10 乙酰化标记在反相色谱中的色谱行为  58-59
      2.2.11 基于乙酰化标记的定量蛋白质组学研究策略  59-61
  3 小结  61-62
  参考文献  62-66
第三章胍基化修饰的乙酰化稳定同位素标记方法的建立与优化  66-80
  1.材料与方法  66-69
    1.1 仪器与试剂  66-67
    1.2 实验方法  67-69
  2.结果与讨论  69-77
    2.1 基于胍基化修饰的乙酰标记原理  70-71
    2.2 基于胍基化修饰的乙酰化标记效率的考察  71-73
    2.3 胍基化修饰的乙酰化稳定同位素标记方法在ESI源质谱中的线性范围考察  73-74
    2.4 基于胍基化修饰的乙酰化稳定同位素标记定量蛋白质组学研究策略  74-77
  3 小结  77-78
  参考文献  78-80
第四章基于稳定同位素标记技术的高通量蛋白质N末端肽组学研究  80-99
  1 材料与方法  81-83
    1.1 仪器与试剂  81-82
    1.2 实验方法  82-83
  2 结果与讨论  83-92
    2.1 N末端特异性识别原理  83-84
    2.2 模式蛋白质的选择  84
    2.3 蛋白质的胍基化修饰  84-86
    2.4 N—末端肽段的特异性识别  86-90
    2.5 规模化识别大肠杆菌蛋白质N末端  90-92
  3 小结  92-93
  参考文献  93-99
第五章乙酰化稳定同位素标记方法在四氯化碳致大鼠肝损伤组织CYP450蛋白质组定量研究中的应用  99-116
  1.材料与方法  100-103
    1.1 仪器与试剂  100
    1.2 实验方法  100-103
  2.结果与讨论  103-109
    2.1 血生化和病理学  103-104
    2.2 胶内标准曲线  104-105
    2.3 微粒体蛋白质SDS-PAGE分离  105-106
    2.4 CYP450蛋白质组定量分析策略  106-107
    2.5 CYP450蛋白定量分析结果  107-109
  3.小结  109-110
  参考文献  110-116
第六章胍基化修饰的乙酰化稳定同位素标记与自动化分析软件MSAQ的研发及其在人血浆定量蛋白质组研究中的应用  116-138
  1 材料与方法  117-122
    1.1 仪器与试剂  117
    1.2 实验方法  117-122
  2 结果与讨论  122-134
    2.1 FT质谱仪质量准确度的评估及校正  122-125
    2.2 胍基化的修饰乙酰化标记方法用于血浆蛋白质定量研究  125-126
    2.3 傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(FTICR-MS)高质量的数据采集  126-127
    2.4 同位素效应  127-129
    2.5 不同定量方法之间的比较  129
    2.6 肽段定量比值和肽段对定量比值的比较  129-131
    2.7 不同阶段肝炎病人血浆定量蛋白质组学分析  131-134
  3.小结  134
  参考文献  134-138
总结  138-140
在读期间研究成果  140-143
致谢  143-145
附:文献综述  145-151

基于乙酰化稳定同位素标记—液相色谱—傅立叶变换离子回旋共振质谱联用的定量蛋白质组研究策略的建立、评价与应用

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