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冬凌草甲素诱导U937细胞凋亡及增强吞噬凋亡小体的机制研究

作　者: 刘艳秋
导　师: 游松；池岛乔
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 冬凌草甲素 凋亡 吞噬 Bcl-2家族 MAPK家族 PI3-K Ras蛋白
分类号: R733.1
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


本文对冬凌草甲素体外诱导人组织淋巴瘤U937细胞死亡机制及增强U937来源的吞噬细胞对紫外（UV）照射诱导的凋亡小体吞噬的机制进行了系统的研究。 实验结果表明，冬凌草甲素对U937细胞有明显的细胞毒活性，抑制细胞生长呈明显的时间和剂量依赖性。形态学方法、核荧光染色及DNA片段化分析实验证实了冬凌草甲素诱导U937细胞死亡机制为诱导细胞凋亡。 U937细胞对27μmol·L-1的冬凌草甲素及Fas激动型抗体CH11 500 ng／ml（作为细胞对Fas敏感性的阳性对照）表现为凋亡敏感性，在研究上游启动凋亡的caspase中，caspase 8特异性抑制剂z-IETD有效地阻断了冬凌草甲素诱导的细胞死亡和DNA片断化，但caspase 1特异性抑制剂Ac-YVAD和caspase 10特异性抑制剂z-AEVD对其没有影响。免疫印迹法显示Fas、FasL和FADD表达上调，caspase 8前体降解，提示Fas／FasL途径参与冬凌草甲素诱导的U937细胞凋亡。冬凌草甲素和CH11诱导ERK MAPK活化，然而ERK特异性抑制剂PD98059逆转了冬凌草甲素诱导的U937细胞死亡和caspase 8前体降解，说明ERK在caspase 8上游调控。另外，抑凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL表达降低，促凋亡蛋白Bax表达增加及细胞色素c释放，同时，caspase-3的酶原被降解，caspase-3底物ICAD（inhibitor of caspase activated DNase）和PARP（poly-（ADP-ribose）polymerase）降解。然而，PD98059逆转了冬凌草甲素对Bcl-XL、Bax和细胞色素c的影响，但对下调的Bcl-2表达没有作用。这些结果说明冬凌草甲素活化的Fas／FasL途径激活的ERK促进了U937细胞对线粒体途径诱导的凋亡敏感性。 1.35 gmol·L-1的冬凌草甲素具有增强U937分化的巨噬细胞对UV照射（52.1J／m2）诱导凋亡的U937细胞的吞噬作用，并呈时间剂量依赖性。加入抗TNFα和抗IL-1β的抗体，培养12h，吞噬增强作用明显受抑制，说明TNFα和IL-1β促进了冬凌草甲素增强的吞噬。另外，冬凌草甲素在人外周血来源的巨噬细胞吞噬凋亡死的U937细胞过程中同样发挥增强吞噬的效果。这些结果说明冬凌草甲素通过诱导TNFα和IL-1β释放增强U937细胞对凋亡小体的吞噬，这种作用可能有利于冬凌草甲素的抗肿瘤活性。

全文目录


中文摘要  10-12
英文摘要  12-15
第一章 绪论  15-47
  第一节 抗肿瘤药物的研究进展  15-16
  第二节 细胞凋亡及分子机制研究进展  16-26
    一、细胞凋亡的特征  16-18
    二、细胞凋亡的一些调控因素  18-22
      1.Caspase蛋白酶与细胞凋亡  18-20
      2.Bcl-2家族成员在细胞凋亡中的作用  20
      3.MAPK家族与凋亡  20-22
    三、细胞凋亡的信号转导途径  22-26
      1.死亡受体途径  22-24
      2.线粒体途径  24-26
  第三节 细胞凋亡的识别及吞噬机制研究进展  26-39
    一、吞噬细胞识别清除凋亡细胞的一般特征  26-28
    二、吞噬凋亡细胞的调控因素  28-29
    三、吞噬凋亡细胞的信号转导途径  29-39
      1.蛋白酪氨酸激酶途径  30-31
      2.磷酸肌醇-3激酶(PI-3K)途径  31-33
      3.小G蛋白途径  33-36
      4.转录因子NF-κB  36-39
      5.MAPK家族与吞噬的调节  39
  第四节 冬凌草甲素药理学研究概述  39-42
    1.抗菌作用  40
    2.抗肿瘤作用  40-41
    3.抗突变作用  41
    4.抗氧化作用  41
    5.镇痛作用  41
    6.其他作用  41-42
  参考文献  42-47
第二章 冬凌草甲素诱导人组织淋巴瘤U937细胞死亡机制研究  47-80
  一、实验部分  47-55
    1.实验材料  47-48
    2.实验方法  48-55
  二、实验结果  55-72
    1.冬凌草甲素诱导U937细胞死亡呈明显剂量与时间依赖关系  55-56
    2.冬凌草甲素诱导U937细胞凋亡的形态学变化  56-57
    3.DNA电泳观察  57-58
    4.冬凌草甲素和激动型Fas抗体CH11对U937生长抑制作用比较  58-59
    5.Caspase 1、8、10抑制剂对冬凌草甲素诱导U937凋亡的影响  59-62
    6.冬凌草甲素对死亡受体复合物表达的影响  62-63
    7.MAPK家族、PTK和PKC对冬凌草甲素诱导U937细胞死亡的影响  63-67
    8.ERK抑制剂PD98059对冬凌草甲素诱导的FADD表达上调和caspase 8前体降解的影响  67-68
    9.Caspase 3的活化及其底物ICAD、PARP的切断  68-69
    10.冬凌草甲素调节Bcl-2、Bcl-X_L和Bax表达及cytochrome c释放  69-70
    11.PD98059对冬凌草甲素诱导的Bcl-2家族蛋白表达的影响及cytochrome c释放的影响  70-72
  三、讨论  72-75
  四、小结  75-77
  参考文献  77-80
第三章 冬凌草甲素增强对凋亡小体吞噬作用的机制研究  80-121
  一、实验部分  80-84
    1.实验材料  80-81
    2.实验方法  81-84
  二、实验结果  84-117
    1.U937细胞经PMA处理分化为吞噬细胞  84-86
    2.UV照射(52.1J／m~2)诱导凋亡小体的形成  86-88
    3.冬凌草甲素增强U937分化的吞噬细胞吞噬凋亡小体呈时间剂量依赖性  88-90
    4.吞噬的形态学观察  90-91
    5.内毒素抑制剂polymyxin B(PB)未影响冬凌草甲素诱导的吞噬刺激  91-92
    6.冬凌草甲素对U937分化的吞噬细胞吞噬红色荧光颗粒的作用  92-94
    7.加入抗体对冬凌草甲素诱导吞噬作用增强的影响  94-95
    8.冬凌草甲素对人外周血来源的巨噬细胞吞噬凋亡小体能力增强作用  95-97
    9.PTK抑制剂genistein对冬凌草甲素诱导的吞噬增强效果的影响  97-98
    10.PI3K,PKC和PLCγ抑制剂对冬凌草甲素诱导的吞噬刺激的影响  98-99
    11.在冬凌草甲素诱导的吞噬刺激的过程中PKC活力增加  99-100
    12.PLCγ2表达增加和PKB／Akt磷酸化的上调  100-103
    13.MAPK在冬凌草甲素诱导的吞噬刺激中的作用  103-106
    14.TNFα和IL-1β抗体对PKC活化和ERK磷酸化的影响  106-109
    15.Ras抑制剂manumycin A阻断了冬凌草甲素诱导的吞噬刺激  109-110
    16.Rafl kinase抑制剂对吞噬刺激的影响  110-111
    17.Ras／Rafl依赖性的ERK活化  111-113
    18.NF-κB活化  113-115
    19.NF-κB依赖的IL-1β前体产生  115-117
  三、讨论  117-119
  四、小结  119-121
参考文献  121-124
缩略语  124-125
致谢  125-126
附录  126-140

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 网状内皮系统肿瘤
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