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甘草素（liquirigenin）诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡及其分子机制的研究

作　者: 刘长伟
导　师: 蔡云清；冯晴；莫宝庆；赵人琤
学　校: 南京医科大学
专　业: 营养与食品卫生
关键词: 甘草素 人宫颈癌HeLa细胞 生长抑制 细胞凋亡 p53 Bcl-2家族 细胞色素C caspase PARP
分类号: R737.33
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病率位居我国妇女恶性肿瘤的第一位,并呈逐年上升且低龄化趋势,严重危害我国女性的健康。因此,研究具有抗肿瘤作用的天然植物化学生理活性物质,预防和治疗宫颈癌已成为国内外研究的一个热点。大量研究表明,天然植物中存在的某些黄酮类化合物(flavonoids)具有较好的抗肿瘤作用。甘草(glycyrrhiza)在我国资源丰富,其属于既是食品又是药品,是中医临床治疗肿瘤处方药中的重要成分之一。甘草素是从甘草中提取的一种二氢黄酮单体化合物。经实验室前期研究表明,甘草素具有抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖并诱导细胞凋亡的作用。体内实验结果显示,甘草素能延长H22荷瘤小鼠的生存时间,并能抑制瘤体增生及诱导肿瘤组织细胞凋亡。最近初步研究发现,甘草素能显著抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖,但是否能诱导HeLa细胞凋亡及其凋亡相关分子机制尚不清楚。本课题拟进一步研究甘草素对人宫颈癌HeLa细胞生长抑制作用,探讨甘草素是否诱导HeLa细胞凋亡及其凋亡机制是否与线粒体途径有关,为甘草素抗宫颈癌作用及其相关分子机制提供依据。目的:探讨甘草素对人宫颈癌HeLa细胞生长抑制及诱导细胞凋亡的影响。方法:本研究经体外培养HeLa细胞,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测甘草素对HeLa细胞增殖的影响;Hoechst染色法观察甘草素诱导HeLa细胞细胞凋亡的形态学改变;用annexin V/PI双染法经流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:不同剂量的甘草素(0.05-0.4 mM)处理HeLa细胞24-72h后,均能够降低HeLa细胞的生存率。随着剂量的增加,细胞存活率不断下降。0.05 mM甘草素作用HeLa细胞24、48和72 h后,细胞存活率分别为93.4%、90.6%和78.9%;0.4mM甘草素处理HeLa细胞相同时间后细胞生存率分别下降到57.8%、30.9%和22.3%。甘草素作用HeLa细胞48和72 h的半数抑制浓度(IC50)分别是0.247 mM和0.137 mM。用0.05-0.2mM的甘草素处理HeLa细胞48h后,甘草素能导致HeLa细胞核出现致密浓染,或呈现碎片状浓染,且随着剂量的增加,致密浓染或碎片浓染的细胞数逐渐增加,并具有一定的剂量效应关系。流式细胞仪分析发现,甘草素能够诱导HeLa细胞凋亡,0.2 mM的甘草素处理HeLa细胞48h后,凋亡率达到46.46%(p < 0.01),而对照组仅为5.81%。结论:甘草素能够抑制宫颈癌HeLa细胞增殖及诱导HeLa细胞凋亡。目的:探讨甘草素诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡的分子机制。方法:通过Western blot方法检测凋亡相关蛋白p53、Bax、Bcl-2、Survivin、cytochrome c、caspase-9、caspase-3和PARP。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测caspase抑制剂验证甘草素对HeLa细胞增殖的影响;用annexin V/PI双染法经流式细胞仪检测caspase抑制剂对甘草素诱导的HeLa细胞凋亡的影响。结果:采用0.05-0.2 mM的甘草素处理HeLa细胞48h后,随着剂量的增加,p53和Bax蛋白表达逐渐增加,0.2 mM甘草素处理组p53和Bax蛋白表达量分别达到对照组的7.60和2.64倍;而Bcl-2和Survivin表达量则下降,在0.2 mM甘草素处理组Bcl-2表达量降到对照组的0.66倍。而Survivin蛋白在甘草素剂量为0.1 mM时已经下降为对照组的0.5倍。随着甘草素剂量的增加,线粒体内的细胞色素C不断下降,在0.1 mM甘草素处理组胞色素C下降为对照组的0.3倍,而胞浆内的则相应的增多,达到对照组的3.3倍。同样,caspase-9、caspase-3和PARP随着甘草素剂量的增加被裂解,而caspase总抑制剂Z-VAD-FMK和caspase-9的抑制剂Z-LEHD-FMK均能显著抑制甘草素诱导的凋亡。结论:甘草素可通过上调p53和Bax,下调Bcl-2,促进细胞色素C的释放及caspase-9和caspase-3的激活经线粒体通路诱导HeLa细胞凋亡。

全文目录


缩略语  4-5
中文摘要  5-9
Abstract  9-13
前言  13-15
第一部分 甘草素对抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖及诱导细胞凋亡作用的研究  15-23
  一、材料与方法  15-17
  二、结果  17-21
  三、讨论  21-22
  四、结论  22-23
第二部分 甘草素诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡的分子机制研究  23-35
  一、材料和方法  23-28
  二、结果  28-33
  三、讨论  33-34
  四、结论  34-35
小结  35-36
参考文献  36-40
综述 黄酮类化合物抗肿瘤机理的研究进展  40-57
  参考文献  49-57
附录  57-58
致谢  58-59

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 女性生殖器肿瘤 > 子宫肿瘤
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