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大熊猫基因资源库构建及粪便高质量DNA提取方法的建立

作　者: 余建秋
导　师: 方盛国；万秋红
学　校: 浙江大学
专　业: 动物学
关键词: 大熊猫 细菌人工染色体 基因组文库 cDNA文库 粪便DNA
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
下　载: 333次
引　用: 1次
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内容摘要


1.本文以大熊猫的成纤维细胞和肝组织细胞为材料,以pBeloBAC11为载体,构建了大熊猫基因组的细菌人工染色体DNA文库。该文库包含了93700个克隆,分别保存于977块96孔细胞培养板中。经过对100个随机抽样的克隆分析表明,插入片段的平均大小为160kb,相当于大熊猫基因组的5倍,即5个库容量。酶切10个克隆证明,经过100代繁殖后,其插入片段仍稳定不变。 2.采用RNeasy Mini Kit提取大熊猫肝脏和脑组织的总RNA,经oligotex试剂盒纯化得到mRNA。利用SMART(switching mechanism at 5’end of RNA transcript)技术,构建了肝脏和脑组织的全长cDNA文库。在构建完成的文库中,肝脏文库含有约5.0×10~6个重组子,而脑组织文库含有约3.5×10~6个重组子。在2个文库中,插入的cDNA长度为400bp—4kb,重组率高达90%以上。鉴定结果表明,大熊猫肝脏和脑组织cDNA文库质量良好,为进一步筛选和克隆大熊猫肝脏与脑组织特异性表达基因,提供了材料平台。 3.通过本研究,建立了从大熊猫粪便样品中提取高质量DNA的技术体系:(1)通过足量粪便提取足量的DNA:(2)加入BSA能有效控制PCR抑制物的干扰作用;(3)通过分级离心的方法富集大熊猫消化道上皮细胞。研究同时表明,使用该方法还能够从福尔马林固定的粪便中提取大片段的DNA。这一技术体系的建立,促进了大熊猫保护遗传学的研究,也为其它野生动物的保护遗传学研究提供了良好的技术借鉴。

全文目录


摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
第一章 文献综述——基因组文库构建及其研究进展  10-17
  1. 基因组文库的产生和发展  10-14
    1.1 克隆载体的发展  10-12
    1.2 细菌人工染色体文库的构建  12-14
  2. 保护遗传学的产生和发展  14-15
  3. 基因组文库在保护遗传学方面的应用及展望  15-17
第二章 大熊猫基因组DNA文库构建  17-40
  1. 材料与方法  18-33
    1.1 材料  18-19
    1.2 试剂  19
    1.3 主要的仪器设备及耗材  19
    1.4 方法  19-33
  2 结果  33-36
    2.1 BAC载体的制备  33-34
    2.2 文库构建的效率  34-35
    2.3 BAC克隆的酶切结果  35
    2.4 克隆稳定性的检测结果  35-36
  3 讨论  36-40
    3.1 克隆载体的制备  36-37
    3.2 高分子量DNA的制备  37
    3.3 脉冲场电泳条带的形成  37-38
    3.4 电转化参数  38-40
第三章 大熊猫肝及脑组织cDNA文库构建  40-51
  1 材料与方法  41-42
    1.1 材料  41
    1.2 试剂  41
    1.3 总RNA抽提与mRNA分离  41
    1.4 DNA合成和文库构建  41-42
    1.5 DNA文库的质量鉴定  42
  2 结果  42-49
    2.1 大熊猫肝cDNA文库  42-46
    2.2 大熊猫脑cDNA文库  46-49
  3 讨论  49-51
第四章 大熊猫粪便高质量DNA提取方法的建立  51-71
  1 材料  52-54
    1.1 样品  52-53
    1.2 试剂  53
    1.3 主要的仪器设备  53-54
  2 方法  54-62
    2.1 DNA提取  54-56
    2.2 银镜反应试验  56-57
    2.3 脉冲场电泳  57
    2.4 PCR扩增  57-58
    2.5 DNA指纹技术  58-60
    2.6 探针标记  60
    2.7 分子杂交  60-61
    2.8 膜或胶的再杂交  61
    2.9 统计分析  61-62
  3 结果与讨论  62-71
    3.1 粪便DNA的提取  62-67
    3.2 粪便DNA的长期保存  67-71
参考文献  71-82
攻读博士论文期间投稿及发表的论文目录  82-83
致谢  83-84
独创性声明  84-85
学位论文版权使用授权书  85

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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