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格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌（Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1）磁小体合成相关基因的克隆及其功能分析

作　者: 李峰
导　师: 李季伦
学　校: 中国农业大学
专　业: 微生物学
关键词: Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1 磁小体缺失突变株 mini-Tn5 lacZ 2 接合转座突变锚定PCR
分类号: Q933
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌（Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1）为趋磁螺菌属（Magnetospirillum）的模式菌株，能够在胞内合成大小约为42am的磁小体（Magnetosome）。实验之初，该菌尚不能在平板上形成菌落，其遗传操作体系尚未建立，难以从分子水平研究其磁小体合成机制。本实验初步建立了该菌简便有效的遗传操作体系。此体系包括：以平板封膜培养技术获得单菌落，在选择性培养液中进行遗传因子接合转移，以液体培养和磁铁吸附技术筛选突变子。并利用此体系，通过接合转座诱变技术，获得了2个磁小体缺失突变株：NM4、NM21。Southern杂交验证磁小体缺失突变确为Tn5插入所致。以Tn5为标签，用锚定PCR法克隆出突变株NM4的Tn5侧翼序列。并以此侧翼序列为标签继续用锚定PCR法向两边延伸，克隆出一个5045bp的DNA片段。该片段由6个ORF组成，Tn5插入在3621 bp-3622bP间，位于ORF4起始密码子下游的84bp处，ORF4因Tn5插入失活，通过功能互补实验证明该片段与磁小体合成相关。通过对ORF4编码蛋白同源比较和功能分析，推测ORF4编码蛋白可能的功能有两种：具ATPase活性，在磁小体合成过程中为铁转运提供能量；或参与磁小体合成启动过程中的信号转导。用锚定PCR法从NM21中克隆出Tn5侧翼序列，得到一个大小为3073bp的DNA片段，此片段由3个ORF组成，与M.magnetotacticum MS-1的对应片段具有89％的同源性。Tn5插入位点在1428bp—1429bp之间，在ORF1起始密码子下游459bp处。ORF1与ORF2仅间隔29bp，可能组成一个操纵子。ORF2与ORF3有14bp的重复。经疏水性和跨膜区分析，ORF1编码的蛋白含有5个疏水区、4个跨膜区，应为跨膜蛋白。功能互补实验证明其与磁小体合成相关。经同源比较和保守性结构域分析，推测ORF1编码的蛋白具有Fe²⁺转运功能，在磁小体合成过程中将细胞质中Fe²⁺转运到磁小体囊泡中，合成磁小体的同时去除Fe²⁺对细胞的毒害作用。

全文目录

中文摘要  3-4
英文摘要  4-7
第一章趋磁细菌的研究进展  7-39
  1.1 趋磁细菌的一般特性  7-9
  1.2 趋磁细菌的生理生化特性  9-13
  1.3 趋磁细菌的生态分布  13
  1.4 趋磁细菌的分类与进化  13-15
  1.5 磁小体的形态、生理生化特性  15-21
  1.6 趋磁细菌的分子生物学  21-31
  1.7 磁小体合成的机制及磁小体的生物学意义  31-35
  1.8 趋磁细菌研究的理论意义及应用价值  35-38
  1.9 结束语  38-39
第二章接合转座突变及其在基因克隆中的应用  39-56
  2.1 接合转移诱动系统  39-42
  2.2 接合转移诱动系统构建  42-46
  2.3 转座子标签法克隆基因  46-56
本论文研究路线和预期目标  56-57
第三章趋磁螺菌遗传操作体系的建立及磁小体缺失突变株的筛选  57-77
  3.1 材料和方法  57-69
  3.2 结果  69-75
  3.3 讨论  75-77
第四章 M.gryphiswaldense磁小体缺失突变株Nu4 Tn5侧翼序列的克隆及序列分析  77-96
  4.1 材料和方法  77-81
  4.2 结果  81-95
  4.3 讨论  95-96
第五章 M.gryphiswaldense磁小体缺失突变株NM21 Tn5侧翼序列的克隆及序列分析  96-111
  5.1 材料和方法  96
  5.2 结果  96-110
  5.3 讨论  110-111
结论  111-112
参考文献  112-129
致谢  129

格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌（Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1）磁小体合成相关基因的克隆及其功能分析

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