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绿脓杆菌蛋白质组和gyrA基因突变在其对环丙沙星耐药进化过程中变化的研究

作　者: 周劲松
导　师: 张今
学　校: 吉林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 环丙沙星 绿脓杆菌 进化过程 基因突变 敏感菌株 细菌耐药性 蛋白质组 蛋白组 药物刺激 耐药机制
分类号: R346
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要


喹诺酮类药物主要通过抑制细菌的DNA解旋酶和拓扑异构酶IV, 使细菌的DNA复制受阻,导致细菌死亡.目前第三代喹诺酮类药物是仅次于头孢菌素的抗菌药,环丙沙星属于第三代喹诺酮类药物,其增强了药物与细菌的结合能力以及对细菌细胞膜的通透性,扩大了抗菌谱、增强了抗菌活性，成为全球第一个口服广谱抗菌药。 近年来国内外医院应用抗生素品种繁多，数量大，导致抗药菌株不断地增加。由于不合理使用抗生素而导致病人抵抗力降低耐药菌株增加，使医院内感染逐渐增多。绿脓杆菌（Pseudomonasaeruginosa， PA） 属假单胞菌属， 是临床上较常见的条件致病菌及院内感染的主要病原体之一， 由于可产生多重抗药性， 从而可导致高死亡率肺炎和败血病 ，因此对绿脓杆菌耐药机制的研究十分重要。 目前， 对绿脓杆菌喹诺酮耐药机制的研究主要集中在 （1）抗生素作用的靶位的改变而使抗菌药物无法发挥作用或亲和力下<WP=146>降 ；（2） 由于细菌细胞膜渗透性的改变使抗菌药物无法进人胞内； （3） 细菌依赖于能量的主动转运系统使已经进入胞内的药物泵至胞外。 几乎所有研究的实验对象是对抗生素完全敏感或已经获得耐药性的菌株， 所以， 其研究结果只是体现了在绿脓杆菌对喹诺酮类药物耐药机制的起始和最终状态 ，而对其耐药机制的启动-执行的信号传递系统无法了解， 这导致目前对细菌耐药性治疗中存在的两个主要问题：（1） 检测手段上只是应用经验指标 （如常规的细菌耐药性检测） 来评估细菌的耐药性 ，而缺乏一种客观的、 严格的指标：（2） 对细菌耐药性治疗的药物几乎没有被开发出来。 因此 ，本研究的目的在于了解绿脓杆菌对环丙沙星耐药进化过程中基因组、 蛋白组所发生的变化 。我们采用连续琼脂糖扩散法和连续试管稀释法在体外模拟绿脓杆菌对环丙沙星耐药的进化过程， 检测在耐药进化过程中与耐药相关的基因的突变情况以确定基因突变发生的时间 ，同时观察在耐药进化过程中蛋白组的变化。 这样， 可以了解绿脓杆菌对环丙沙星耐药过程中细菌耐药机制是如何得以启动、 实现的。 这将为建立一种检测细菌耐药性的严格的、 客观的指标提供了依据 ，并为研制新的抗细菌耐药性药物提供新的药物靶点。 在本研究中 ，我们体外模拟了绿脓杆菌对环丙沙星耐药进化过程 ，这个过程与其在人体内发生的耐药过程极为相似，Adler-Mosca, H 等发现在人体内同一菌株在治疗的过程中从敏感转变为耐药。 绿脓杆菌在人体器官如肺、 伤口、 尿道等表面的生长可用琼脂平板培养进行模拟， 在人血液中的生长可用MH肉汤培养进行模拟 在连续药物扩散法体外模拟细菌耐药的进化过程 ，使用两株绿脓杆菌PA1（ATCC27853） 和 PA0102205 这两株细菌在实验开始时对所有的抗生素均是敏感的 ，经过连续的药物 （环丙沙星）刺激， 这两株绿脓杆菌均成为稳定的耐环丙沙星的菌株 ，在整个耐药进化过程中 ，环丙沙星对PA1（ATCC27853）和 PA0102205<WP=147>的耐药进化行为十分类似 ：在最初的几轮药物刺激中 ，PA1 （ ATCC27853 ）和 PA0102205 均保持对环丙沙星敏感的特性（抑菌环直径》21mm）； 随着药物刺激的持续，细菌对环丙沙星的耐受力加大， 耐药别性进入中介区（ 16mm《抑菌环直径《20mm）， 这种耐药特征均保持了三轮的筛选： 随后， PA1（ ATCC27853） 和 PA0102205呈现耐环丙沙星的特征（抑菌环直径《15mm），并且随着药物刺激的延续，对环丙沙星的耐受力不断加大， 直至完全耐药（抑菌环直径≈6mm）。 为确定PA1（ ATCC27853） 和 PA0102205 对环丙沙星的耐药的稳定性 ，将每一轮药物扩散法实验中的到的菌体均进行无药的连续培养， 即将菌体在MH琼脂培养基中涂布培养， 无药连续培养共进行16轮，每一轮均用药物扩散法测定菌体抑菌环的大小结果表明 ：每一轮药物扩散法实验中的到的菌体在其独自的无药连续培养中所表现的对环丙沙星的耐药性是相似的， 而且一旦药物扩散法实验中的到的菌体的耐药级别进入中介区 ，其每一轮无药连续培养的菌体的耐药性几乎不变（ 抑菌环的直径几乎不变）。 在连续试管稀释法体外模拟细菌耐药的进化过程， 两株绿脓杆菌 PA1（ ATCC27853） 和 PA0102205 的耐药进化行为也十分类似： 在最初的几轮药物刺激中PA1（ ATCC27853） 和 PA0102205均保持对环丙沙星敏感的特性 （MIC≤1 ug/ml);随着药物刺激的持续,细菌对环丙沙星的耐受力加大,耐药别性进入中介区( 1ug/ml < MIC < 4 ug/ml 这种耐药特征均保持了三轮的筛选;随后, PA1( ATCC27853) 和 PA0102205 呈现耐环丙沙星的特征( MIC≥ 4 ug/ml), 并且随着药物刺激的延续, 对环丙沙星的耐受力不断加大, 直至完全耐药 (MIC≈8 ug/ml). 研究表明，无论是“ 连续药物扩散法 ”还是 “连续试管稀释法 ”在体外均可成功地模拟绿脓杆菌对环丙沙星耐药的全部过程。在整个耐药进程中所获得的菌株为进一步研究细菌的耐药进化机制提供了良好的实验材料。 通过 PCR-SSCP、 基因测序等方法?

全文目录


第一章 前言  9-43
  第一节 细菌对抗生素耐药性的概述  9-26
    一 菌耐药性机制概述  9-11
    二 细菌对喹诺酮类抗菌药物产生耐药性的作用机制  11-25
      (一) 喹诺酮类抗菌药物的作用机制  11-12
      (二) 喹诺酮类抗菌药物的作用靶位  12-14
      (三) 喹诺酮类与 DNA 拓扑异构酶复合物的交互作用  14-15
      (四) 喹诺酮类-DNA-拓扑异构酶复合物与 DNA 复制叉 和 RNA 多聚酶的交互作用  15-16
      (五) 细菌对喹诺酮类抗菌药物产生耐药性的基因突变机制  16-22
      (六) 细菌对喹诺酮类药物产生耐药性的主动外排机制  22-25
    三 细菌耐药性的检测  25-26
  第二节 蛋白质组技术及其应用现状  26-41
    一 蛋白质组学研究的意义及发展趋势  26-28
    二 蛋白质组学研究的相关技术  28-37
      (一) 蛋白质组研究中的样品制备  28-29
      (二) 双向电泳技术  29-31
      (三) 图像分析技术  31-33
      (四) 蛋白质的质谱分析技术  33-35
      (五) 蛋白质微测序  35
      (六) 蛋白组数据库  35-36
      (七) 蛋白质组研究的新技术  36-37
    三 医学蛋白质组学研究的应用  37-41
      (一) 人类疾病的蛋白质组研究  37-39
      (二) 病源微生物蛋白组研究  39-41
  第三节 本研究的立题依据及意义  41-43
第二章 实验方法及结果  43-114
  第一节 体外模拟绿脓杆菌对环丙沙星耐药的进化过程  44-59
    实验材料及试剂  44-45
    实验仪器  45
    实验方法  45-53
      1 细菌菌株的保存  45-46
      2 连续琼脂糖扩散法体外模拟绿脓杆菌环丙沙星耐药的进化过程  46-49
      3 连续试管稀释法体外模拟绿脓杆菌环丙沙星耐药的进化过程  49-51
      4 环丙沙星在绿脓杆菌体内浓度的测定  51-53
    实验结果  53-59
      1 连续药物扩散法体外模拟细菌耐药的进化过程  53-56
      2 连续试管稀释法体外模拟细菌耐药的进化过程  56
      3 环丙沙星在绿脓杆菌体内浓度的测定  56-59
  第二节 绿脓杆菌耐药进化过程中基因突变的分析  59-76
    实验材料及试剂  59-60
    实验仪器  60
    实验方法  60-63
      1 DNA 提取  60-61
      2 PCR 扩增  61-62
      3 SSCP 分析  62-63
      4 基因突变的稳定性分析  63
      5 PCR 产物的序列测定  63
      6 DNA 测序结果的计算机分析  63
    实验结果  63-76
      1 PCR-SSCP 检测 QRDRs 基因突变  63-65
      2 PCR 产物的序列测定及计算机分析  65-67
      3 突变稳定性的分析  67-76
  第三节 绿脓杆菌耐药进化过程的蛋白质组学研究  76-105
    实验材料及试剂  76-79
    实验仪器及计算机软件  79-80
    实验方法  80-93
      一 样品准备  80-82
      二 双向电泳  82-86
        1 第一向等电聚焦电泳  82-83
        2 第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳  83-84
        3 聚丙烯酰胺凝胶染色  84-86
      三 绿脓杆菌的理论蛋白组数据库的建立  86
      四 双向电泳凝胶的计算机图像分析  86-87
      五 蛋白质的质谱分析  87-92
      六 蛋白质 N 末端氨基酸测序  92-93
    实验结果  93-105
      1 标准蛋白质浓度 OD595 曲线的绘制  93
      2 2D 电泳样品上样量测定  93-94
      3 双向电泳结果  94-95
      4 Phoretix-2D 图像分析  95-96
      5 差异蛋白的质谱分析  96-103
      6 N 末端氨基酸测序  103-105
  第四节 “可能的 ABC-ATP 结合因子”的功能分析  105-114
    实验材料及试剂  105-106
    实验仪器  106
    实验方法  106-109
      1 细菌 RNA 提取  106
      2 RT-PCR 扩增  106-107
      3 DNAzyme 的设计与构建  107-108
      4 DNAzyme 转染 P. aeruginosa  108-109
    实验结果  109-114
      1 在细菌耐药进化过程中'可能的ABC-ATP结合因子'mRNA的表达  109-110
      2 DNAzyme 抑制细菌耐药性  110-112
      3 DNAzyme 及对照 H2O/对照 DNAzyme处理菌体，其体内环丙沙星菌体浓度的变化  112-114
第三章 实验结果讨论  114-129
  一 研究绿脓杆菌对环丙沙星耐药进化过程的意义  114-117
  二 绿脓杆菌对环丙沙星耐药进化过程中基因突变的分析  117-120
  三 绿脓杆菌对环丙沙星耐药进化过程蛋白组变化的分析  120-129
    1 蛋白组研究方法  120-125
    2 绿脓杆菌对环丙沙星耐药进化过程蛋白组变化  125-127
    3 “可能的 ABC-ATP 结合因子”功能研究  127-129
实验结论  129-131
参考文献  131-144
攻博期间发表的学术论文及其他成果  144-145
中文摘要   145-152
英文摘要   152-157
致谢  157-160

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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