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顺铂诱导人胃癌细胞株BGC-823耐药过程中hMLH1、hMSH2蛋白表达的变化

作　者: 赵宝霞
导　师: 吕申
学　校: 大连医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 胃癌 顺铂 错配修复基因 耐药机制
分类号: R735.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要


背景与目的:胃癌是常见的恶性肿瘤,手术辅以化疗是治疗胃癌的主要方法,但常因该肿瘤易产生耐药性而失败。肿瘤耐药性是指肿瘤细胞对化疗药物的不敏感性,是导致化疗失败的重要原因,也是当前肿瘤研究的热点之一。目前常用多药耐药性(multidrug resistance,MDR)解释肿瘤细胞耐药性产生的机制,对耐药机制的研究主要包括细胞药物外排作用的增强,细胞药物解毒作用的增强,药物作用细胞靶点的变化,肿瘤细胞凋亡的障碍等。然而,目前临床上仍没有能普遍应用的有效逆转肿瘤耐药性方法,这提示应该从新的角度来研究这一问题。细胞适应环境的重要方式是基因突变,肿瘤细胞能否通过自身突变逃避药物攻击呢?错配修复系统(mismatch repair system,MMR)主要功能是检出并修复在DNA复制中逃脱了DNA聚合酶校对亚单位检测的错配碱基,避免遗传物质突变积累,以保证DNA复制高度保真。近年来国外报道,MMR基因缺失的肿瘤细胞会出现对甲基化剂类抗肿瘤药物的耐受[1],一些耐药的肿瘤细胞有MMR表达缺陷[2],当MMR重新表达后,其耐药性可得以逆转。这些研究提示了肿瘤细胞耐药性产生与错配修复基因表达间的关系。但以往的研究多集中于大肠癌和卵巢癌,我国常见的胃癌在该方面的研究很少有报道。本研究以自建的人胃癌顺铂耐药细胞株BGC-823/cDDP为载体,检测诱导后细胞株的生物学行为变化及耐药性的产生情况和诱导前后肿瘤细胞<WP=5>肺耐药蛋白(lung resistance protein,LRP)、谷胱甘肽-S-转移酶π(glutathione-S-transferase-π,GST-π)及错配修复基因hMLH1、hMSH2的表达,初步探讨耐药性产生与错配修复基因产物表达的关系,以期证明细胞错配修复基因功能丧失是肿瘤细胞产生耐药性的机制之一,希望能为逆转肿瘤耐药性提供一些帮助。方法:1.BGC-823/cDDP耐药细胞株的建立及耐药前后生物学行为的观察。采用逐步递增顺铂(Cisplatin, cDDP)浓度、间歇作用体外诱导法,建立人胃癌顺铂耐药细胞株BGC-823/cDDP;MTT法检测新建耐药株的耐药指数及交叉耐药性;倒置显微镜下观察亲本细胞株和耐药细胞株在药物作用后的细胞形态学差异;通过细胞群体倍增时间、细胞周期分布及染色体核型分析等方法观察耐药前后细胞的生物学特征变化,以确定耐药株的建立。 2.检测与多药耐药相关的蛋白及错配修复蛋白。免疫细胞化学法检测多药耐药相关的蛋白LRP、GST-π及错配修复蛋白hMLH1、hMSH2的表达;蛋白质免疫印迹法检测错配修复蛋白hMLH1、hMSH2的表达,比较细胞株耐药产生前后上述蛋白表达的变化,探讨这些蛋白在人胃癌细胞株BGC-823对顺铂产生耐受过程中的作用。结果:1.历时8个月建成的人胃癌顺铂耐药细胞系BGC-823/cDDP对顺铂的耐药指数为3.93,同时对5-氟尿嘧啶、长春新碱及羟基喜树碱的耐药指数分别为1.87、2.03、2.77; BGC-823/cDDP细胞与BGC-823相比形态上存在差异,群体倍增时间延长(P<0.01), S期细胞增多、G0/G1与G2/M期细胞减少;染色体数目分布离散。 2.免疫细胞化学示:BGC-823/cDDP与BGC-823细胞均有LRP与GST-π表达,但BGC-823/cDDP细胞两者的表达均强于BGC-823细胞;BGC-823/cDDP与BGC-823细胞均有错配修复蛋白hMLH1表达,二者未见明显区别;BGC-823/cDDP细胞的hMSH2表达明显低于BGC-823细胞。蛋白质免疫印迹检测示:BGC-823/cDDP与BGC-823细胞错配修复蛋白hMLH1含量无明显差别(P>0.05);BGC-823/cDDP细胞错配修复蛋白hMSH2蛋白含量显著低于BGC-823细胞(P<0.01)。结论:1.利用逐步递增药物浓度、间歇作用体外诱导法从人胃癌<WP=6>细胞株BGC-823诱导出耐药细胞株BGC-823/cDDP,耐药指数为3.93。耐药株BGC-823/cDDP细胞的生物学特性与亲本株BGC-823细胞相比存在差异,细胞的形态结构有差异且增殖减慢、染色体数目的分布离散。 2.BGC-823/cDDP细胞LRP及GST-π的表达均强于BGC-823细胞,说明顺铂诱导后的BGC-823/cDDP细胞已产生了耐药性。 3.与BGC-823细胞相比耐药株BGC-823/cDDP细胞错配修复基因hMLH1表达无显著性差异,但hMSH2的表达明显降低,说明在顺铂诱导BGC-823细胞耐药过程中,肿瘤细胞错配修复基因hMSH2的表达有缺失趋势。4.在顺铂诱导人胃癌细胞株BGC-823耐药的过程中,细胞先启动自身的防御机制LRP、GST-π,以抵制药物的攻击,当药物作用超出了细胞自身的防御后,肿瘤细胞可能会通过自身基因突变来适应药物环境。 5.错配修复基因蛋白功能降低导致的肿瘤细胞基因不稳定性可能是耐药性产生的原因之一。

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 胃肿瘤
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