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曲格列酮肝细胞毒性作用及其机制研究

作　者: 王堃
导　师: 仲来福
学　校: 大连医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 曲格列酮肝细胞毒性氧化性损伤凋亡细胞色素 P450 酶抑制酶诱导 Taqman RT-PCR Western blot HPLC
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

曲格列酮（troglitazone）属于噻唑烷二酮类（thiazolidinedione），是新型口服胰岛素增敏剂，用于Ⅱ型糖尿病的治疗。该药通过过氧化物酶体增殖体激活的γ受体（peroxisome proliferator-activated γ receptor，PPAR_γ）而抑制TNF-α信号转导作用，致使血糖降低，缓解胰岛素抵抗。据统计，曲格列酮自1997年在美国上市以来，引起大约40名患者发生急性肝功能损伤，导致26名患者因肝功能严重衰竭死亡，部分肝功能损伤的患者需要肝脏移植。肝脏病理检查结果显示该药引起肝细胞坏死和纤维化病变。2000年美国FDA已将曲格列酮撤出市场。到目前为止，曲格列酮肝脏毒性作用的机理尚不清楚，有人认为其肝脏毒性作用可能与特异质反应（idiosyncratic reaction）有关。为了进一步了解曲格列酮对肝脏的损害作用以及其可能的中毒机制，为防治中毒和新药开发提供参考依据，我们进行了以下方面的研究：第一部分曲格列酮细胞毒性作用及其对大鼠肝细胞的氧化性损伤目的：用原代大鼠肝细胞模型和不同来源建株细胞系，观察比较曲格列酮在大鼠肝细胞和不同细胞系毒性作用的剂量-效应关系。观察谷胱甘肽合成抑制剂丁硫堇磺氧亚胺（D，L-buthionine-S，R-sulfoximine，BSO）及抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）对曲格列酮肝细胞毒性的影响。同时进一步研究曲格列酮对原代大鼠肝细胞的氧化性损伤作用，探讨曲格列酮肝细胞毒性的可能机制。方法：用4-[3-（4-iodophenyl）-2-（4-nitrophenyl）-2H-5-tetrazolio]-1，3-benzene disulfonate（WST-1）比色法和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）释放法检测曲格列酮的细胞毒性作用以及BSO、NAC对曲格列酮细胞毒性的影响。用荧光检测法、生物发光法、Annexin-V-FLUOS／Propidium iodide（PI）共标记和荧光染色等方法，观察曲格列酮对肝细胞的氧化性损伤作用，探讨曲格列酮肝细胞毒性的可能机制。结果：曲格列酮的细胞毒性呈显著的时间-依赖和剂量-依赖性。作用5小时后，其在原代培养大鼠肝细胞的IC₅₀值最低，并与其对HepG2细胞的IC₅₀值接近；与大鼠肝细胞相比，曲格列酮在Hela细胞和3T3细胞的毒性作用明显减弱，其在Hela细胞和3T3细胞的ICS。值分别约为原代肝细胞的4倍和8倍。BSO能明显加重曲格列酮的肝细胞毒性作用，NAC则能有效预防其细胞毒性作用。与对照组细胞相t匕，曲格flJ酮50林M作用。，5小时一3小时后可诱导活性氧（reaetiveoxygen sPeeies，ROS）生成增加，作用5小时后ROS未检出。曲格#lJ酮引起肝细胞还原型谷肤甘肤（redueed glutathione，GSH）水平显著降低，该作用呈时间和剂量依赖性。曲格列酮50林M使肝细胞腺昔三磷酸（adenosine triphosphate，ATp）水平和线粒体膜电位（mitochondrialmembrane potential，MMP）水平比对照细胞显著降低;不同剂量的曲格列酮作用5小时后肝细胞凋亡发生率和坏死发生率均随浓度的增高而增加，呈明显的剂量一效应关系。结论:（l）曲格列酮对大鼠肝细胞的细胞毒性作用强于其对细胞系，尤其是非肝细胞来源的细胞系的细胞毒性作用，提示，曲格列酮对大鼠肝细胞的细胞毒性作用可能与肝细胞细胞色素P45o（eytoehrome P45o，eYP45o，eYP）氧化酶催化生成活性代谢中间体有关。（2）曲格列酮的肝细胞毒性可能与细胞内GSH氧化还原状态有关。（3）曲格列酮可以诱导肝细胞ROS生成增加，并使GSH水平显著降低，提示曲格列酮可以引起肝细胞氧化性损伤。（4）曲格列酮50林M可显著减少肝细胞ATP的生成，并伴随MMP明显降低，提示肝细胞线粒体损伤。（5）曲格列酮诱导大鼠肝细胞凋亡和坏死发生，该作用呈明显的剂量依赖性。曲格列酮所致肝细胞凋亡和坏死可能与氧化性损伤有关，有待进一步研究证实。线粒体损伤是曲格列酮肝细胞毒性的原因或仅为细胞损伤的后果仍需进一步研究证实。第二部分曲格列酮对肝微粒体CYP450氧化酶的抑制作用目的:研究曲格列酮对肝微粒体CYP45o氧化酶的抑制作用并探讨其与肝毒性的关系。方法:应用高效液相色谱（high pressure liquid ehromatography，HPLC）法测定曲格列酮和阳性抑制剂对肝微粒体皋酮一6p一轻化酶、咪达哇仑一1气轻化酶（CYP3A4）、7一乙氧基一试卤灵一O一脱乙基酶（CYPIA）、丁吠洛尔轻化酶（CYPZD）和甲苯磺丁脉轻化酶（CYPZC819）活性的抑制作用。结果:曲格列酮对肝微粒体咪哒哇仑一1气经化酶和甲苯磺丁服经化酶活性具有抑制作用;其对肝微粒体辜酮一6p一轻化酶、7一乙氧基一试卤灵一O一脱乙基酶和丁吠洛尔轻化酶活性无抑制作用。结论:曲格列酮对肝微粒体CYP3A4和CYPZC819的抑制作用可能引起其自身血药浓度增高，加重或诱发其肝毒性;同时，曲格列酮对微粒体酶的抑制作用可能引起药物相互作用，诱发或加重肝损伤。第三部分曲格列酮对原代培养大鼠肝细胞CYP450氧化酶的诱导作用及其与肝细胞毒性的关系目的：研究曲格列酮对原代培养大鼠肝细胞CYP3A、CYPIA和 CYPZB的诱导作用，并初步探讨药酶诱导作用与其肝毒性的关系。方法：采用 T＆qffisllRTPCR、W6StCrnblot及 HpLC

全文目录

一、论文  5-88
  (一) 中文摘要  5-8
  (二) 英文摘要  8-12
  (三) 前言  12-15
  (四) 参考文献  15-18
  (五) 第一部分曲格列酮细胞毒性作用及其对大鼠肝细胞的氧化性损伤  18-39
     材料与方法  18-22
     结果  22-30
     讨论  30-34
     结论  34-35
     参考文献  35-39
  (六) 第二部分曲格列酮对肝微粒体CYP450氧化酶的抑制作用  39-50
     材料与方法  39-41
     结果  41-44
     讨论  44-46
     结论  46-47
     参考文献  47-50
  (七) 第三部分曲格列酮对原代培养大鼠肝细胞CYP450氧化酶的诱导作用及其与肝细胞毒性的关系  50-77
     材料与方法  50-56
     结果  56-71
     讨论  71-74
     结论  74-75
     参考文献  75-77
  (八) 附图Ⅰ  77-78
  (九) 附图Ⅱ  78-85
  (十) 附图Ⅲ  85-87
  (十一) 致谢  87-88
二、文献综述  88-98
  (一) 正文  88-95
  (二) 参考文献  95-98

曲格列酮肝细胞毒性作用及其机制研究

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