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中国被毛孢甾醇提取最优条件的正交法研究

作　者: 郑林
导　师: 杨晓彤
学　校: 上海师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 中国被毛孢 总甾醇 麦角甾醇 正交法 HPLC
分类号: S567.35
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


冬虫夏草[Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.]是传统名贵中药,具有保护呼吸系统、维护肾功能、抗癌、抗氧化等作用。其无性型为中国被毛孢(Hirsutella sinensis Liu, Guo, Yu & Zeng),具有广阔应用前景。甾醇类物质是冬虫夏草主要活性成分之一,其中麦角甾醇是真菌特征甾醇,具有显著的抗癌活性,本课题主要对中国被毛孢甾醇提取的最优条件进行研究。对磷硫铁法和香草醛-冰醋酸比色法测定总甾醇含量进行了方法学研究,2种方法显色1小时后吸光值变化幅度均小于1%,稳定性较好；精密度RSD分别为1.9%和3.6%；回收率分别为126.3±16.5%和105.4±3.6%,香草醛-冰醋酸法准确度更高；选择香草醛-冰醋酸法为中国被毛孢总甾醇含量的测定方法。单因素实验考查皂化用碱量、乙醇浓度、提取时间、料液比、提取次数5个因素对超声波辅助提取总甾醇的影响,发现皂化用碱量、乙醇浓度、提取次数三因素相邻水平差异显著(P<0.05),而提取时间、料液比(除1/100外)对提取影响均无统计学显著性(P>0.05)；再以KOH/菌丝体比值分别为0、0.5、1,乙醇浓度分别为60%、80%、95%,提取次数分别为1、2、3的3因素3水平正交法优化超声波辅助提取条件,得最佳提取条件为：KOH/菌丝体比值为1,乙醇浓度为95%,提取3次,并测得总甾醇含量约为5.016%±0.205%。单因素试验显示温度对热回流提取效果影响很小；以与超声波法相同的3因素3水平正交设计对热回流法进行考察,得最佳提取条件为：回流温度50℃,KOH/菌丝体比值为0.5,乙醇浓度为95%,提取2次,每次1小时。验证试验显示,超声波法优于热回流法。建立了RP-HPLC测定中国被毛孢总麦角甾醇含量的方法,以Hypersil C18反向色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),纯甲醇流动相,上样量201μL,流速1.0mL/min,检测波长282nm,测得总麦角甾醇含量为0.08%。

全文目录


摘要  2-3
Abstract  3-10
第一章 冬虫夏草的成分和药理作用  10-24
  1.1 冬虫夏草介绍  12-14
    1.1.1 冬虫夏草的无性型的确定  12
    1.1.2 冬虫夏草的甾醇类物质  12-14
  1.2 冬虫夏草的药理作用  14-21
    1.2.1 肾功能维护作用  14-15
      1.2.1.1 对肾毒性损伤的治疗作用  14-15
      1.2.1.2 对肾功能衰竭的治疗作用  15
      1.2.1.3 对肾炎的治疗作用  15
    1.2.2 保护呼吸系统、调节心血管系统的功能  15-17
    1.2.3 机体免疫调节功能  17-18
    1.2.4 抗肿瘤  18-19
    1.2.5 抗氧化、清除体内自由基作用  19
    1.2.6 神经系统调节作用  19-20
    1.2.7 抗菌抗病毒作用  20
    1.2.8 保护肝脏的作用  20-21
    1.2.9 其他作用  21
  1.3 课题的提出、目的和内容  21-24
    1.3.1 课题的提出  21-22
    1.3.2 课题的目的  22
    1.3.3 课题的设计、研究内容  22-24
      1.3.3.1 课题设计  22-23
      1.3.3.2 研究内容  23-24
第二章 材料和方法  24-35
  2.1 磷硫铁法测定中国被毛孢总甾醇含量方法学研究  24-26
    2.1.1 材料和仪器  24
      2.1.1.1 材料  24
      2.1.1.2 仪器  24
    2.1.2 试剂和溶剂配制  24-25
      2.1.2.1 试剂  24
      2.1.2.2 10%FeCl3·6H2O磷酸溶液  24-25
      2.1.2.3 磷硫铁显色液  25
      2.1.2.4 麦角甾醇标准品制备  25
    2.1.3 样品制备  25
    2.1.4 实验方法  25-26
      2.1.4.1 显色方法  25
      2.1.4.2 测定波长检测方法  25
      2.1.4.3 标准曲线绘制方法  25-26
  2.2 香草醛-冰醋酸法测定中国被毛孢总甾醇含量方法学研究  26-27
    2.2.1 材料和仪器  26
      2.2.1.1 材料  26
      2.2.1.2 仪器  26
    2.2.2 试剂和溶剂配制  26
      2.2.2.1 化学试剂  26
      2.2.2.2 香草醛-冰醋酸显色液  26
    2.2.3 样品制备  26-27
    2.2.4 实验方法  27
      2.2.4.1 显色方法  27
      2.2.4.2 测定波长确定方法  27
      2.2.4.3 标准曲线绘制方法  27
  2.3 超声波辅助提取中国被毛孢总甾醇  27-30
    2.3.1 材料和仪器  27-28
      2.3.1.1 材料  27-28
      2.3.1.2 仪器  28
    2.3.2 试剂和溶剂配制  28
    2.3.3 实验方法  28-30
      2.3.3.1 单因素分析皂化用碱量的影响  28
      2.3.3.2 单因素实验分析乙醇浓度影响  28-29
      2.3.3.3 单因素实验分析提取时间影响  29
      2.3.3.4 单因素实验分析料液比影响  29
      2.3.3.5 单因素实验分析提取次数影响  29-30
      2.3.3.6 正交试验  30
  2.4 热回流法提取中国被毛孢总甾醇  30-32
    2.4.1 材料和仪器  30-31
      2.4.1.1 材料  31
      2.4.1.2 仪器  31
    2.4.2 试剂和溶剂配制  31
    2.4.3 实验方法  31-32
      2.4.3.1 单因素实验分析热回流温度影响  31
      2.4.3.2 正交试验  31-32
  2.5 RP-HPLC测定中国被毛孢麦角甾醇含量  32-35
    2.5.1 材料和仪器  32-33
      2.5.1.1 材料  32
      2.5.1.2 仪器  32-33
    2.5.2 试剂和溶剂配制  33
      2.5.2.1 试剂  33
      2.5.2.2 麦角甾醇标准品配制  33
    2.5.3 样品制备  33
    2.5.4 实验方法  33-35
      2.5.4.1 色谱条件  33-34
      2.5.4.2 流动相的选择  34
      2.5.4.3 标准曲线绘制方法  34-35
第三章:中国被毛孢总甾醇含量测定和提取方法研究  35-51
  3.1 磷硫铁法测定中国被毛孢总甾醇含量方法学研究  35-38
    3.1.1 吸收波长的确定  35
    3.1.2 标准曲线的建立  35-36
    3.1.3 稳定性实验结果  36-37
    3.1.4 精密度实验结果  37
    3.1.5 回收率实验结果  37-38
    3.1.6 分析与讨论  38
  3.2 香草醛-冰醋酸法测定中国被毛孢总甾醇含量方法学研究  38-42
    3.2.1 吸收波长的确定  38-39
    3.2.2 标准曲线的建立  39
    3.2.3 稳定性试验  39-40
    3.2.4 精密度试验  40
    3.2.5 回收率试验  40-41
    3.2.6 分析与讨论  41-42
  3.3 正交优化超声波辅助提取中国被毛孢总甾醇方法  42-47
    3.3.1 单因素分析皂化用碱量的影响  42
    3.3.2 单因素实验分析料液比影响  42-43
    3.3.3 单因素实验分析提取时间影响  43
    3.3.4 单因素实验分析乙醇浓度影响  43-44
    3.3.5 单因素实验分析提取次数的影响  44-45
    3.3.6 正交试验结果  45-46
    3.3.7 验证试验  46
    3.3.8 分析与讨论  46-47
  3.4 正交优化热回流提取中国被毛孢总甾醇方法  47-49
    3.4.1 单因素分析热回流温度的影响  47-48
    3.4.2 正交试验结果  48-49
    3.4.3 验证试验  49
    3.4.4 分析与讨论  49
  3.5 小结  49-51
第四章 RP-HPLC测定中国被毛孢麦角甾醇含量  51-57
  4.1 Hypersil BDS C18(210mm×4.6mm,5 m)色谱柱结果  51-53
    4.1.1 100%甲醇流动相等度洗脱结果  51
    4.1.2 90%甲醇流动相等度洗脱结果  51-52
    4.1.3 乙腈/甲醇(75/25,V/V)流动相等度洗脱结果  52
    4.1.4 A甲醇/水(80/20,V/V),B甲醇/二氯甲烷(75/25,V/V)梯度洗脱结果  52-53
  4.2 Hypersil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5m)  53-56
    4.2.1 纯甲醇流动相色谱图  53-54
    4.2.2 标准曲线绘制  54-55
    4.2.3 中国被毛孢麦角甾醇含量测定  55-56
    4.2.4 讨论  56
  4.3 小结  56-57
总结  57-58
致谢  58-59
参考文献  59-66
附  66-68

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 药用作物 > 菌类 > 冬虫夏草
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