HERG通道在爪蟾卵母细胞的持续表达、电流变化与动力学分析目的:探索一个HERG(human ether-à-go-go–related gene)通道在爪蟾卵母细胞持续稳定表达HERG通道的方法,研究表达培养不同时期卵母细胞膜静息电位和通道电流特性的变化。探讨在电生理记录" />
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获得性LQTS药物作用HERG通道分子位点与功能研究

作　者: 王宪沛
导　师: 廖玉华
学　校: 华中科技大学
专　业: 内科学
关键词: HERG 钾通道 爪蟾卵母细胞 通道表达 通道动力学 阿司咪唑 HERG 抗组胺药物 氟派啶醇 非洲爪蟾卵母细胞 心律失常 QT间期 抗精神病药 硫利哒嗪
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


第一部分HERG 的学位论文">HERG通道在爪蟾卵母细胞的持续表达、电流变化与动力学分析目的:探索一个HERG(human ether-à-go-go–related gene)通道在爪蟾卵母细胞持续稳定表达HERG通道的方法,研究表达培养不同时期卵母细胞膜静息电位和通道电流特性的变化。探讨在电生理记录的过程中,HERG通道应分析的通道动力学参数及机制。方法:用含HERG片段的pSP64载体质粒体外转录制备mRNA注射表达于卵母细胞,用双电极电压钳技术记录通道电流,编制不同的刺激脉冲分析各动力学参数。结果:(1)本方法可成功在卵母细胞持续表达与HERG通道电生理特性一致的功能性通道,并可在10～15内稳定用于电生理记录。(2)在培养的第3、6和9天细胞膜静息电位负值逐渐升高,在第12天又开始降低。异源表达的HERG通道内向整流的最大电位在第3、6和9天逐渐向正向转移,在第12天又回复,激活曲线的半最大激活电压(V1/2)在培养的第3、6和9天逐渐向负向转移,在第12天又逐渐回复,其改变和膜静息电位的变化趋势一致。(3)HERG通道在去极化脉冲下由于存在快失活而呈内向整流性。激活曲线可通过拟合去极化脉冲及随之的尾电流峰值而得到。激活的时间依赖性可通过拟合去极化不同时程与相应的尾电流峰值而得到。(4)HERG的去激活的I-V(电流-电压)关系曲线仍呈明显的内向整流性,尾电流的衰减路径用双指数方程拟合可得到快和慢两个时间常数。(5)HERG通道的失活呈电压依赖性,分别用两个不同的三脉冲程序,可得到通道的失活曲线以及去除失活后近乎线性的I-V关系。结论:本研究提供了一种HERG基因在爪蟾卵母细胞长期持续表达的方法,并为HERG通道的分子位点和药物作用研究在不同实验条件电生理实验数据的差异提供依据。同时虽然HERG通道动力学复杂,仍可设计不同脉冲程序对其通道动力学间接进行分析,为HERG的分子位点作用研究提供基础。第二部分阿司咪唑结合于S6区域Y652和F656位点阻断开放状态HERG通道目的:第二代抗组胺药物阿司咪唑对心肌细胞HERG通道的阻断作用可导致获得性长QT综合征(LQTS)。我们全面的研究了阿司咪唑阻断HERG通道的生物物理学特性和作用的分子位点。方法:HERG通道表达在非洲爪蟾卵母细胞上,利用双电极电压钳技术测量其电流。结果:阿司咪唑以电压依赖性和浓度依赖性的方式阻断野生型的HERG通道电流。利用尾电流包裹程序(envelope of tails)记录,阿司咪唑显示对HERG通道微小的张力性阻断。阻断特征符合对通道开放状态的阻断。阿司咪唑浓度依赖性的显著提高HERG电流失活的慢成分的时间常数。而稳态失活的V1/2值、全激活电流和稳态电流的电流-电压(I-V)曲线没有被阿司咪唑的阻断明显改变。阿司咪唑电压依赖性的加速HERG通道的失活时程。孔道S6区域的突变,Y652A和F656A可显著减弱阿司咪唑对HERG通道的阻断作用。同野生型HERG通道的阻断相比,Y652A突变使阻断的IC50提高11倍,而F656A突变使阻断的IC50提高404倍。结论:阿司咪唑优先阻断开放的HERG通道,Y652和F656是阿司咪唑同通道结合的两个关键的位点,可能是抗组胺药物分子内的四胺基连接的侧链同HERG通道孔道内的结合位点相互作用。第三部分氟派啶醇阻断野生型和突变型HERG通道的生物特性和分子作用位点研究目的:抗精神病药物氟派啶醇在治疗浓度通过阻断HERG通道延长QT间期,导致Tdp等致命性心律失常。我们研究了氟派啶醇阻断野生型和Y652突变型HERG通道的生物学特性,并测试了氟派啶醇阻断HERG通道的分子作用位点。方法:HERG通道表达在非洲爪蟾卵母细胞上,利用双电极电压钳技术测量其电流。结果:氟派啶醇以浓度依赖性和轻微的电压依赖性的方式阻断野生型的HERG电流,其对HERG通道的激活曲线没有显著的影响。用包裹性的尾电流测试脉冲评价,氟派啶醇对HERG电流显示张力性的阻断,并且使激活曲线向负向转移。而Y652AHERG突变通道被氟派啶醇的阻断同野生型的阻断相比有相似的通道动力学阻断特性。S6区域的突变,Y652A和F656A,显著的减弱氟派啶醇对通道的阻断能力。阻断的IC50在Y652A突变提高21倍,在F656A突变提高161倍。结论:Y652A突变通道没有显著的改变氟派啶醇阻断HERG通道的生物学特性。Y652和F656是氟派啶醇阻断HERG通道的两个关键的作用位点。第四部分硫利哒嗪结合于S6区域F656位点阻断关闭状态和开放状态的HERG通道目的:抗精神病药物硫利哒嗪通过阻断HERG通道延长心肌细胞复极和心电图的QT间期。本研究的目的是(i)研究硫利哒嗪阻断HERG通道的特征,(ii)研究硫利哒嗪对HERG的阻断的分子作用位点。方法:HERG通道表达在非洲爪蟾卵母细胞上,利用双电极电压钳技术测量其室温下的电流。结果:硫利哒嗪以浓度依赖性的方式阻断野生型的HERG通道,其阻断的IC50是7.3μM。硫利哒嗪对HERG通道产生一个张力性的阻断,在最初的去极化时程就产生时间依赖性的阻断,在负于+40mV的去极化电压下产生电压非依赖性的阻断。在正于40mV的去极化脉冲下阻断能力减弱,这显示通道的失活可以减弱硫利哒嗪的阻断作用。因此,硫利哒嗪优先阻断关闭和开放状态的HERG通道,而不阻断失活状态的HERG通道。去极化的快和慢时间常数被加速,缺乏“foot in the door”效应。失活曲线向负向转移,失活速率提高。S6区域的Y652A和F656A突变使硫利哒嗪对HERG通道阻断的IC50分别提高4倍和25倍。结论:S6区域的F656位点是硫利哒嗪阻断HERG通道的主要作用位点,其阻断关闭和开放状态的HERG通道。硫利哒嗪同以前研究的开放状态的通道阻断剂不同,而可能同BeKm-1对关闭状态的通道作用的机理相同。

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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