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1.双环醇对免疫性肝纤维化大鼠的保护作用及机制研究 2.Beagle犬口服富马酸泰诺福韦二吡呋酯和BP0018后血浆药代动力学及生物利用度研究

作　者: 谷雨
导　师: 郭顺星；李燕；程桂芳；陈晓光；申竹芳
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 生药学
关键词: 免疫性肝纤维化牛血清白蛋白双环醇细胞因子 Smad 2/3 p38 MAPK MMP-2 TIMP-1 BP0018 富马酸泰诺福韦二吡呋酯泰诺福韦抗病毒药代动力学生物利用度
分类号: R965
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

第一部分双环醇对免疫性肝纤维化大鼠的保护作用及机制研究肝纤维化(liver fibrosis,)是指肝细胞发生坏死及炎症刺激时,肝脏内纤维结缔组织异常增生的病理过程,不仅是慢性肝病最重要的病理特征之一,也是慢性肝炎、肝硬化进一步发展、恶化的重要原因。虽然目前认为肝纤维化是可逆的病理过程,但若不进行及时有效的治疗,最终可发展为不可逆转的肝硬化、甚至肝癌。因此,研究肝纤维化的形成机理及预防和治疗肝纤维化已成为世界医药学攻关中的热点课题之一。目前用于研究肝纤维化机制的常用动物模型包括CCl4、二亚基亚硝胺、胆管结扎、免疫性肝纤维化模型等,其中免疫性肝纤维化模型具有与临床慢性肝炎所致的肝纤维化在发病机制上更加接近,适合于慢性肝炎的免疫机制研究的特点。双环醇是中国医学科学院药物研究所研制的抗肝炎药,已用于治疗慢性病毒性肝炎。临床资料显示,双环醇可明显改善慢性乙型、丙型病毒性肝炎患者临床症状和肝功能损伤,兼有一定抑制乙型肝炎病毒复制的作用,同时具有反跳率低、不良反应小、服用方便的特点。以往研究表明,双环醇对多种实验性肝损伤均有明显的保护作用,其保护机制与清除活性氧自由基、调控细胞因子分泌、抑制免疫损伤诱发的凋亡等相关。本文应用牛血清白蛋白诱导的大鼠免疫性肝纤维化模型,进一步了解双环醇对肝纤维化的保护作用特点,并从细胞核转录因子、细胞因子调控等方面探讨双环醇保护作用机制,为临床应用提供科学可靠的实验依据。双环醇对免疫性肝纤维化大鼠肝损伤的保护作用及机制研究牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)诱导大鼠肝纤维化模型的发生机制是基于异种血清白蛋白进入体内后可刺激机体产生抗体,继而形成免疫复合物激活补体,引发Ⅲ型变态反应造成血管炎、血管周围炎等局部免疫炎症反应,进一步刺激胶原的增生而形成肝纤维化。本研究应用的BSA诱导大鼠肝纤维化模型可见肝脏羟脯氨酸(Hydroxyproline,Hyp)水平升高,血清透明质酸(Hyaluronic Acid, HA)和三型前胶原肽(Procollagen TypeⅢ, PⅢP)含量显著增加,肝间质胶原纤维和胶原蛋白增多,汇管区出现网状纤维和胶原纤维的超常增生等纤维化病理变化,与以往研究相符。给药组于攻击阶段开始四周后开始给予双环醇(100,200,300 mg／ml)每日一次,连续给药5周可显著降低BSA诱导肝纤维化大鼠肝脏Hyp、血清HA及PIIIP水平的升高,上述炎症细胞浸润、纤维组织增生等肝脏病理形态学改变也明显减轻。已知肝纤维化形成过程与肝细胞外基质沉积的增加和改变密切相关,主要特征为肝星状细胞激活,转化生长因子(Transforming growth factorβ-1, TGF-β1)及其下游细胞调控子活性发生改变。TGF-β1可调节细胞外基质(Extracellularmatrix, ECM)网状系统成分如纤维胶原和纤维链接蛋白的表达,同时也对蛋白酶抑制因子包括基质金属蛋白酶抑制剂(Tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMPs)进行调节。以往研究表明,TGF-β1信号传导通路已成为预防、治疗肝纤维化的一个重要靶点。本研究结果显示,双环醇可在mRNA和蛋白水平显著抑制肝TGF-β1的过表达,提示双环醇可通过下调肝TGF-β1从而防止肝纤维化的形成。肝脏受损后TGF-β可通过细胞内TGF-β/Smad信号通路激活并加速肝星状细胞分化为成肌纤维细胞。此外,TGF-β／Smad通路还可与其他信号通路相互作用,增加或抑制Smad蛋白的磷酸化,其中最重要的是活化蛋白激酶通路(MAPK),如p38 MAPK。已有研究证实,Smad3的磷酸化作用依赖p38 MAPK,促进肌成纤维细胞体外和体内ECM的产生,而P38 MAPK在多重刺激下可被各种MAPKKKs激酶激活,进而在不同水平促进成肌细胞分化。本研究可见,双环醇给药组中Smad2／3磷酸化程度明显降低,且p38 MAPK的磷酸化也相应受到抑制,提示双环醇对TGF-β1表达的抑制作用至少与Smad2／3和p38 MAPK信号通路调控相关。IL-1是重要的炎症因子之一,其促进肝纤维化的机制主要包括以下两方面：1)IL-1在肝组织中所产生的炎症反应可激活p38、JNK,从而导致肝纤维化生成；2)IL-1能够上调TIMP-1mRNA表达,促进ECM的蓄积从而发生肝纤维化。本研究中可见BSA诱导大鼠血浆白介素-1β(Interleukin-1β, IL-1β) mRNA水平明显升高,双环醇可抑制IL-1β的升高,可能与双环醇通过抑制p38MAPK从而减轻肝脏炎症反应有关。此外,在肝纤维化过程中,TNF-α对HSC的增殖、活化以及ECM的合成、基质金属蛋白酶及其组织抑制剂的释放起重要作用。BSA诱导肝纤维化大鼠TNF-αmRNA水平明显升高,双环醇可显著降低其表达。白介素-10(Interleukin-10, IL-10)是体内重要的抗炎因子,与其受体结合后可抑制多种炎症因子和促纤维化因子包括IL-1β等。肝脏免疫炎症过程中可见Kupffer细胞、HSCs和肝浸润T细胞中IL-10 mRNA的高表达。以往研究显示,外源性IL-10能拮抗CCl4诱导的大鼠肝纤维化,并能抑制体外培养活化HSCTGF-β1和碱性成纤维生长因子mRNA表达及促进HSC凋亡。本研究发现,BSA攻击大鼠后肝IL-10反应性升高,而双环醇可减少IL-10的过表达。推测由于双环醇显著下调肝脏前炎症因子的表达,抑制肝脏炎症反应,从而反馈式降低了IL-10的增加。以往研究表明,肝纤维化中胶原的沉积与降解和基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase, MMPs)及TIMPs密切相关。在健康肝脏中,ECM稳态环境通过MMPs指导精确调节。而在慢性肝损伤中,肝星状细胞被激活、分化为成纤维细胞样表型。与此同时,在活化HSCs中TIMP-1表达上调导致MMP活性的抑制以及随后细胞外间隙基质蛋白蓄积。本研究可见,双环醇使BSA诱导的MMP-2和TIMP-1 mRNA过表达显著降低。尽管尚不能确定胶原活性的增加是否是双环醇抑制TIMP-1表达的结果,但TIMP-1的减少以及胶原酶活性的增加常伴随肝纤维化的逆转。有报道显示,IL-1激活p38 MAPK可导致TIMP-1的上调。综合上述结果,双环醇可能通过调节TGF-β1,抑制炎症因子表达(抑制IL-1β),抑制p38MAPK的磷酸化,干扰TIMP-1从而抑制胶原表达,防止肝纤维化的发生。由此可见,其机制作用与防止炎症反应的发生,从而使IL-10水平反馈性降低,与此同时,双环醇的治疗可使MMP-2和TIMP-1表达显著降低,分析是通过抑制p38 MAPK的磷酸化,干扰TIMP-1抑制胶原表达,最终防止肝纤维化的发生。综上所述,双环醇对BSA诱导的肝纤维化具有明显保护作用,其作用机制可归纳为：1)通过Smad2／3和p38MAPK信号通路调控TGF-β1和IL-1β的表达,抑制肝细胞外基质沉积；2)抑制炎症因子TNF-α和IL-1的表达,从而改善炎症因子／抗炎因子平衡；3)通过调控MMP-2及TIMP-1,抑制胶原表达从而治疗肝纤维化。上述研究为进一步了解双环醇的肝保护作用特点以及临床上应用于肝纤维化的治疗提供了有参考价值的实验依据。第二部分Beagle犬口服富马酸泰诺福韦二吡呋酯和BP0018后血浆药代动力学及生物利用度我国是肝病大国,以慢性乙肝为主,携带HBsAg的人数已经达到总人口的10%,每年新增乙肝患者约为50万,而每年死于乙肝的人数约为28万。与此同时,据最新统计数据显示,全球已有2500万人死于HIV感染,目前HIV感染者尚有3300万人,在我国,现存HIV病毒感染者人和病人已超过70万人。抗HIV和抗HBV药物研发对我国病毒感染性疾病的治疗有着巨大社会和经济意义。Viread一种具有高度抗HBV和HIV活性的新型核苷类逆转录酶抑制剂,已在美国和欧洲获批治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)感染,同时也是抗慢性乙肝药物的有效药物之一,可通过干扰乙肝病毒DNA聚合酶的功能,抑制乙肝病毒复制,降低血清及肝组织内的病毒载量。BP0018是江苏正大天晴药业研制的抗病毒新药,与Viread一样,均为泰诺福韦(PMPA)的前药。本文旨在研究Beagle犬单次口服viread和BP0018后血浆药代动力学特点,并计算生物利用度,为BP0018临床合理用药的安全性和有效性提供依据。本研究根据化学药物制剂生物利用度和生物等效性研究技术指导原则,对Beagle犬单次口服BP0018和参比制剂viread的体内血浆药代动力学和生物利用度进行研究。研究结果表明：(1)本研究所建立的用于测定生物样品中泰诺福韦、BP0018和泰诺福韦二吡呋酯的HPLC-MS／MS方法不受杂质干扰,日内精密度RSD小于2.8%,日间精密度RSD小于10.1%,回收率在80.9%至93.1%之间,RSD均小于8.2%,且稳定性良好,可满足体内药代动力学研究要求。(2)Beagle犬单次口服BP0018和参比制剂后各时间点原型药浓度均低于最低检测限(5ng／mL),但血中均可检测到泰诺福韦(PMPA),其浓度随给药后不同时间而变化；(3)BP0018和参比制剂PMPA的达峰时间分别为0.25-1h和0.25-2h,达峰浓度分别为328.06-65.74ng／mL和331.21±22.74ng／mL,体内平均滞留时间(MRT)分别为6.87±1.52h和4.35±1.61h；(4)与参比制剂相比BP0018平均滞留时间(6.876.87±1.52h)和消除半衰期(14.95±9.49h)均有所延长,而AUC(0-t)、AUC(0-∞)、Cmax和Tmax无显著性差别。(5) Beagle犬单次静脉注射PMPA后,血浆药物浓度于给药后2min迅速达峰,24h仍能检测到一定浓度PMPA,36h血浆中PMPA浓度低于检测限。(6) Beagle犬单次口服给药BP0018的体内生物利用度为20.7±4.3%,而参比制剂富马酸泰诺福韦二吡呋酯的生物利用度为16.8±6.2%。综上所述,本文对Beagle犬单次口服富马酸泰诺福韦二吡呋酯和BP0018后血浆药代动力学特点进行了研究,并计算其生物利用度,结果显示,两药主要药代动力学参数无明显差异,生物利用度结果提示基本等效,为BP0018临床合理用药的安全性和有效性提供实验依据。

全文目录

目录  3-6
缩略词表(Abbreviation)  6-8
第一部分双环醇对免疫性肝纤维化大鼠的保护作用及机制研究  8-50
  摘要  8-11
  Abstract  11-14
  引言  14-16
  材料和方法  16-41
    1. 实验材料  16-17
    2. 实验方法  17-24
    3. 实验结果  24-41
      3.1 双环醇对免疫性肝纤维化大鼠肝纤维化生成的保护作用  24-28
        3.1.1 肝脏病理检查结果  24-26
        3.1.2 双环醇对免疫性肝纤维化大鼠肝脏羟脯氨酸Hyp升高的保护作用  26
        3.1.3 双环醇对免疫性肝纤维化大鼠血清HA、PIIIP升高的保护作用  26-27
        3.1.4 双环醇对免疫性肝纤维化大鼠血清TGF-β1升高的保护作用  27-28
      3.2 双环醇对免疫性肝纤维化大鼠生化指标的影响  28-29
        3.2.1 双环醇对免疫性肝纤维化大鼠血清ALT、AST的影响  28-29
        3.2.2 双环醇对免疫性肝纤维化大鼠血清总蛋白、白蛋白含量、白蛋白/球蛋白(A/G)比例及TBiL的影响  29
      3.3 双环醇对免疫性肝纤维化大鼠TGF-β1及信号转导通路的影响  29-33
        3.3.1 双环醇对免疫性肝纤维化大鼠肝脏TGF-β1mRNA表达的影响  29-30
        3.3.2 双环醇对免疫性肝纤维化大鼠肝脏TGF-β1蛋白含量的影响  30-31
        3.3.3 环醇对免疫性肝纤维化大鼠Smad2/3的影响  31-32
        3.3.4 环醇对免疫性肝纤维化大鼠p38 MAPK通路的影响  32-33
      3.4 双环醇对免疫性肝纤维化大鼠肝脏炎症因子表达的影响  33-37
        3.4.1 双环醇对免疫性肝纤维化大鼠肝脏IL-1β mRNA表达的影响  33-34
        3.4.2 双环醇对免疫性肝纤维化大鼠肝脏IL-10 RNA表达的影响  34-35
        3.4.3 双环醇对免疫性肝纤维化大鼠肝脏TNF-α mRNA表达的影响  35-36
        3.4.4 双环醇对免疫性肝纤维化大鼠肝脏IL-6 mRNA表达的影响  36-37
      3.5 双环醇对免疫性肝纤维化大鼠肝脏细胞外基质生成与降解的影响  37-41
        3.5.1 双环醇对免疫性肝纤维化大鼠肝脏MMP-2 mRNA表达的影响  37-38
        3.5.2 双环醇对免疫性肝纤维化大鼠肝脏TIMP-1 mRNA表达的影响  38-39
        3.5.3 双环醇对免疫性肝纤维化大鼠肝脏MMP-13 mRNA表达的影响  39-41
  讨论  41-44
  小结  44-45
  参考文献  45-50
第二部分 Beagle犬口服富马酸泰诺福韦二吡呋酯和BP0018后血浆药代动力学及生物利用度研究  50-93
  摘要  50-52
  Abstract  52-54
  引言  54-55
  第一章高效液相色谱-质谱联用法测定生物样品内泰诺福韦、泰诺福韦二吡呋酯以及BP0018含量的方法建立及验证  55-68
    1 实验材料  55
    2 实验方法  55-57
      2.1 生物样品中泰诺福韦检测方法的建立  55-56
      2.2 生物样品泰诺福韦二吡呋酯检测方法的建立  56-57
      2.3 生物样品BP0018检测方法的建立  57
    3 实验结果  57-67
      3.1 生物样品内泰诺福韦检测方法的验证  57-61
      3.2 生物样品泰诺福韦二吡呋酯检测方法的验证  61-64
      3.3 生物样品BP0018检测方法的验证  64-67
    4 讨论  67-68
  第二章 Beagle犬口服富马酸泰诺福韦二吡呋酯和BP0018后血浆药代动力学及生物利用度  68-91
    1 实验材料  68
    2 实验方法  68-69
    3 实验结果  69-89
      3.1 Beagle犬口服BP0018和富马酸泰诺福韦二吡呋酯后血浆药代动力学  69-83
        3.1.1 Beagle犬口服BP0018后血浆药代动力学  69-74
        3.1.2 Beagle犬口服参比制剂富马酸泰诺福韦二吡呋酯后血浆药代动力学  74-79
        3.1.3 Beagle犬单次口服BP0018和富马酸泰诺福韦二吡呋酯后血浆药代动力学比较分析  79-83
      3.2 Beagle犬单次口服BP0018和富马酸泰诺福韦二吡呋酯后体内生物利用度  83-89
    讨论  89-91
  参考文献  91-93
论文综述  93-106
致谢  106-107
附录  107-109

1.双环醇对免疫性肝纤维化大鼠的保护作用及机制研究 2.Beagle犬口服富马酸泰诺福韦二吡呋酯和BP0018后血浆药代动力学及生物利用度研究

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