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红景天苷干预细胞衰老的分子机制及其防治骨质疏松活性的研究

作　者: 毛根祥
导　师: 李电东；王真；邓洪斌
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 红景天苷细胞衰老氧化应激 BMP2 骨质疏松
分类号: R285
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

红景天(Rhodiola)为景天科红景天属多年生草本或亚灌木植物,是珍稀药用植物之一,被誉为“高原人参”。大量实验研究和临床观察表明,红景天具有多种药理活性,包括增加机体免疫力、刺激神经系统、抗应激反应、抗疲劳、抗缺氧等,具有典型的“适应原样”作用。红景天苷是红景天的主要活性成分之一。本实验室先前的研究表明红景天苷能有效延长果蝇寿命,有效下调D-半乳糖诱导的衰老小鼠体内晚期糖基化产物(AGE)水平,并显著改善小鼠的神经系统和免疫系统,展现出良好的抗衰老效应。本研究中,我们采用氧化应激诱导的早熟性衰老模型、复制性衰老及DNA损伤诱导的细胞衰老模型,从细胞和分子水平进一步探讨了红景天苷干预衰老的效应机制。衰老的自由基学说是一个经典的衰老理论,研究表明红景天苷是一个抗氧化剂,但其抗氧化活性与其干预衰老的作用尚缺乏直接的实验依据。我们首先应用亚致死量的H202作用于年轻的2BS细胞(PD28)建立早熟性细胞衰老模型,同时采用红景天苷进行干预,结果表明红景天苷能显著逆转H202诱导的衰老样改变,包括细胞形态、SA-β-Gal染色阳性率、G1期阻滞以及衰老相关蛋白p53、p21和p16等的表达上调。红景天苷的这种保护作用具有一定的剂量依赖性,在5μM剂量下效果最佳。在该模型中,红景天苷的抗氧化活性也得到了证实,该化合物能显著下调模型细胞内ROS含量,5μM剂量下与2mM的NAC效果相当,同时下调MDA含量,对总SOD活力及蛋白表达也有一定的上调作用。与此同时,采用复制衰老性细胞衰老模型发现,红景天苷能显著延迟2BS细胞的复制性衰老,延长2BS细胞代龄8PD左右,对衰老表型的影响与其在H202模型中的相似。进一步的实验表明,在上述两个模型中采用NAC对比研究发现,红景天苷降调节p53、p21部分依赖于ROS水平的下降,尚有ROS非依赖机制。这可能的原因是红景天苷能直接调节DNA损伤修复的相关分子表达进而改变由此诱导的衰老样表型。为此,我们采用一种具有强烈DNA断裂活性的烯二炔类抗肿瘤抗生素——力达霉素(0.1nM)作用于年轻2BS细胞,在分子水平上,红景天苷能显著减少LDM诱导的DNA损伤程度——γ-H2AX水平,并且依然能逆转LDM引起的p53、p21表达上调；同时,对力达霉素诱导年轻2BS细胞产生的衰老样表型也有一定的逆转作用。此外,我们发现红景天苷能显著促进2BS细胞内线粒体的增殖,这可能是红景天苷发挥延缓衰老作用的新机制,并且其效果与相同剂量的白藜芦醇相当,但其机制可能不同于白藜芦醇,SIRT1抑制剂并不能抑制红景天苷的促线粒体增殖效应。这些研究表明红景天苷具有良好的延缓衰老的效应,该效应一方面与其抗氧化活性相关,一方面也与直接调节DNA损伤修复相关。此外,骨质疏松是一种常见的与增龄密切相关的代谢性骨病,通过改善骨质代谢、增强成骨细胞的作用,最终达到恢复患者骨量水平为目的的治疗方案日益受到人们的重视。骨形态形成因子2(bmp2)基因的表达对于成骨细胞活性及其分化有着关键作用。我们通过一种以bmp2为靶点的新型抗骨质疏松药物筛选模型发现,红景天苷能有效上调小鼠颅骨细胞MC3T3-E1中BMP2的表达效应,表明该化合物可能具有一定的促骨形成能力。为证实红景天苷的这一效应,我们首先采用大鼠成骨细胞(ROB)和人成骨样细胞MG63研究了红景天苷对成骨细胞的影响,测定了红景天苷对成骨细胞增殖以及成骨性标志物碱性磷酸酶(ALP)和胶原合成的影响；进而采用雌性大鼠去势模型,观察了红景天苷对绝经后骨质疏松症模型的作用。体外研究表明,红景天苷作用于ROB细胞后,能显著促进成骨性的骨形成：MTT试验表明红景天苷促进细胞增殖达30%左右,ALP活性测定表明经红景天苷作用后其活性上调30%,3H-脯氨酸掺入试验表明红景天苷作用成骨细胞后其胶原合成增加1倍左右。在MG63细胞中我们观察到了相似的结果。此外,real-time RTPCR检测发现,MG63细胞内bmp2的mRNA表达水平在1μM和5μM的红景天苷作用48h后上调接近1倍；Western blot结果表明红景天苷能剂量依赖和时间依赖地上调ROB和MG63细胞中的BMP2蛋白表达水平。体内实验结果表明红景天苷能剂量依赖地抑制去势大鼠的骨量减少,与阳性药物雷洛昔芬效果相当,但对于破骨细胞的活性则无显著的抑制作用,间接地说明了红景天苷增加骨量不是依赖于抑制骨吸收而是促进成骨性的骨形成。这些结果显示了该化合物具有良好的防治骨质疏松的应用前景。综上所述,本研究结果表明,红景天苷在细胞水平上具有显著的延缓衰老的作用,这一方面得益于红景天苷的抗氧化作用,能有效减少ROS引起的损伤,另一方面红景天苷本身可能具有促进DNA损伤修复的功能,从而抑制p53-p21衰老相关信号通路的活化。并且,红景天苷具有显著的促线粒体增殖的效应,这可能是其发挥延缓衰老作用的新机制。另外,红景天苷具有显著的上调bmp2的作用,能促进成骨性的骨生成,具有良好的抗骨质疏松病的应用前景。

全文目录

中文摘要  6-8
Abstract  8-11
缩略语  11-14
第一部分红景天苷干预细胞衰老的机制研究  14-77
  前言  14-18
  材料与方法  18-29
  实验结果  29-60
    一红景天苷对H_2O_2诱导的细胞衰老的干预作用及机制  29-40
      1.1 亚致死量H_2O_2诱导2BS细胞衰老模型的建立  29
      1.2 红景天苷对H_2O_2处理的2BS细胞活力及细胞形态的影响  29-31
      1.3 红景天苷对H_2O_2处理的2BS细胞SA-β-gal染色阳性率的影响  31-33
      1.4 红景天苷对H_2O_2处理的2BS细胞周期的影响  33-35
      1.5 红景天苷有效下调模型细胞内ROS水平  35-36
      1.6 红景天苷对模型细胞T-SOD活性及MDA水平的影响  36-37
      1.7 红景天苷对衰老相关蛋白的影响  37-40
      1.8 红景天苷下调模型细胞内衰老相关蛋白表达与ROS的关系  40
    二红景天苷对复制性细胞衰老的干预作用及机制  40-52
      2.1 红景天苷对不同代龄2BS细胞的促增殖作用  41
      2.2 红景天苷延缓2BS细胞的复制性衰老  41-43
      2.3 红景天苷对50PD2BS细胞内ROS影响  43-44
      2.4 红景天苷对50PD2BS细胞T-SOD活性及MDA的影响  44-45
      2.5 红景天苷对50PD2BS细胞衰老相关蛋白的影响  45-47
      2.6 红景天苷下调50PD2BS细胞衰老相关蛋白与ROS的关系  47-49
      2.7 红景天苷对50PD2BS细胞线粒体增殖的影响  49-51
      2.8 红景天苷对50PD2BS细胞sirtuin蛋白的影响  51
      2.9 SIRT1抑制剂sirtinol对红景天苷促进线粒体增殖活性的影响  51-52
    三红景天苷对力达霉素诱导的细胞衰老的干预作用及机制  52-60
      3.1 力达霉素对年轻2BS细胞的增殖抑制作用  53-54
      3.2 红景天苷对力达霉素增殖抑制作用的影响  54-55
      3.3 红景天苷对力达霉素处理的2BS细胞SA-β-gal染色阳性率的影响.  55-56
      3.4 红景天苷对力达霉素处理的年轻2BS细胞周期的影响  56-57
      3.5 红景天苷对力达霉素引起的DNA损伤水平的影响  57-58
      3.6 红景天苷对力达霉素引起的衰老相关蛋白变化的影响  58-60
  讨论  60-67
  参考文献  67-77
第二部分红景天苷防治骨质疏松活性的研究  77-102
  前言  77-79
  材料与方法  79-86
  实验结果  86-96
    1 大鼠成骨细胞(ROB)的鉴定  86
    2 红景天苷对大鼠成骨细胞成骨性标志物的影响  86-89
    3 红景天苷对人成骨样细胞MG63的增殖及碱性磷酸酶活性的影响  89-91
    4 红景天苷上调成骨细胞中bmp-2 mRNA表达水平  91
    5 红景天苷上调成骨细胞中bmp-2蛋白表达水平  91-92
    6 红景天苷对NF-κB活性的影响  92-93
    7 红景天苷对去势雌鼠骨质疏松模型的作用  93-96
  讨论  96-99
  参考文献  99-102
论文结论  102-103
文献综述  103-115
个人简历  115-118
附录  118-126
致谢  126

红景天苷干预细胞衰老的分子机制及其防治骨质疏松活性的研究

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