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猪IL-12和IL-18对TGEV S基因核酸疫苗免疫效应的研究

作　者: 李训良
导　师: 任晓峰
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪传染性胃肠炎病毒 S基因猪白细胞介素12 猪白细胞介素18 免疫佐剂
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

猪传染性胃肠炎(Porcine transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的一种高度接触性、急性消化道传染病。预防该病主要是靠接种疫苗。本实验分别将猪传染性胃肠炎病毒S基因与猪IL-12基因亚克隆至真核表达载体pVAX1中,构建了两个重组真核表达质粒pVAX1-TGEV S1和pVAX1-pIL-12。通过脂质体转染法将pVAX1-TGEV S1和pVAX1-pIL-12转入BHK细胞中进行了表达,且表达的蛋白可以被多克隆抗体所检测。以pVAX1-TGEV S1和pVAX1-pIL-12重组真核表达质粒免疫小鼠。共分为9组,分别是空白组、PBS组、pVAX1组、pIL-12组、pIL-12+pIL-18组、TGEV S组、TGEV S+pIL-12组、TGEV S+pIL-12+pIL-18组和疫苗组。利用淋巴细胞转化试验、酶联免疫吸附试验、流式细胞仪技术、检测特异性CTL活性实验、病毒中和试验和细胞因子检测试验对不同处理组小鼠的各项免疫指标进行了检测。试验结果表明,各免疫组小鼠的各项免疫指标均比pVAX1组、PBS组和空白组高,加入佐剂联合免疫组的结果尤为显著。在淋巴细胞增殖试验、酶联免疫吸附试验、病毒中和试验、细胞因子检测试验、T细胞亚型CD4+、CD8+数量变化检测以及特异性CTL活性的检测试验中,加佐剂抗原组的效果明显要优于其他组别。病毒中和试验和酶联免疫吸附试验检测抗TGEV IgG的抗体结果显示,疫苗组产生抗体的效果优于其他各组。流式细胞术检测和细胞因子检测试验中发现佐剂免疫组对机体免疫应答也有辅助的增强作用。本实验还构建了一个pGEX-6p-pIL-12(p40)原核表达质粒,质粒缺失pIL-12 N(p40)端22 aa信号肽序列。在大肠杆菌中获得了高效表达的pIL-12(p40)蛋白。纯化后蛋白免疫新西兰兔获得兔源多克隆抗体。酶联免疫吸附试验和免疫荧光结果表明pIL-15蛋白与多克隆抗体具有良好的特异性反应。本研究首次将pIL-12基因、pIL-18基因与TGEV S基因质粒联合免疫。实验结果表明pIL-12基因以及pIL-12基因和pIL-18基因联合作为TGEV S抗原基因的分子佐剂,不但能促进机体的细胞免疫应答,而且能够提高机体体液免疫应答,进而提高了机体的免疫反应。为进一步研究细胞因子作为免疫佐剂的作用提供了依据,为新型核酸疫苗的研究奠定了理论基础。

全文目录

中文摘要  10-11
英文摘要  11-13
1 前言  13-23
  1.1 猪传染性胃肠炎（TGE）  13
  1.2 猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的基本特征  13-15
    1.2.1 TGEV 形态学特征  13-14
    1.2.2 TGEV 的培养特性  14
    1.2.3 TGEV 的理化特性  14
    1.2.4 TGE 的流行与症状  14-15
    1.2.5 TGE 的诊断  15
  1.3 TGEV 的分子生物学进展  15-17
    1.3.1 TGEV 基因组结构及表达  15-16
    1.3.2 TGEV 结构蛋白及其功能  16-17
    1.3.3 TGEV 非结构蛋白及其功能  17
  1.4 TGE 疫苗研究进展  17-20
    1.4.1 常规疫苗  17-18
    1.4.2 基因工程疫苗  18-20
  1.5 细胞因子免疫佐剂  20-22
    1.5.1 猪白细胞介素12  20-21
    1.5.2 猪白细胞介素18  21-22
  1.6 实验目的和意义  22-23
2 材料与方法  23-40
  2.1 实验材料  23-25
    2.1.1 实验动物  23
    2.1.2 细胞株、菌株、载体及质粒  23
    2.1.3 主要工具酶、抗体及分子生物学试剂盒  23
    2.1.4 主要生化试剂  23-24
    2.1.5 主要试剂的配制和贮存  24
    2.1.6 主要实验仪器设备  24-25
  2.2 试验方法  25-40
    2.2.1 TGEV 51 基因、pIL-12 基因的亚克隆及其真核表达质粒的构建  25-30
    2.2.2 pIL-12(p40)原核表达载体的构建  30-31
    2.2.3 重组质粒pGEX-6p-pIL-12(p40)的诱导表达及纯化  31-32
    2.2.4 抗pIL-12(p40)多克隆抗体的制备及鉴定  32-33
    2.2.5 pVAX1-TGEV 51 和pVAX1-pIL-12(p40)-linker-pIL-12(p35)重组质粒体外瞬时表达及其表达产物的检测  33-34
    2.2.6 pVAX1-TGEV 51 、pVAX1-pIL-12(p40)-linker-pIL-12(p35)和pVAX-pIL-18 重组质粒在小鼠体内的应用及其免疫效果的检测  34-40
3 结果  40-59
  3.1 TGEV 51 基因及pIL-12 基因的亚克隆及其真核表达质粒的构建及鉴定  40-42
    3.1.1 TGEV 51 重组真核表达质粒的构建与鉴定  40-41
    3.1.2 pIL-12 重组真核表达质粒的构建与鉴定  41-42
  3.2 pGEX-6p-pIL-12(p40)重组蛋白的诱导表达及纯化  42-44
    3.2.1 pGEX-6p-pIL-12(p40) 重组蛋白的诱导表达  42-43
    3.2.2 pGEX-6p-pIL-12(p40)重组蛋白的纯化  43-44
  3.3 抗pIL-12(p40)多克隆抗体的制备及鉴定  44-45
    3.3.1 酶联免疫吸附实验（ELISA）检测多抗效价  44
    3.3.2 蛋白免疫印记实验（western blot）检测抗体特异性  44-45
  3.4 真核表达质粒体外转染及其表达产物的检测  45-47
    3.4.1 TGEV S1 基因真核表达质粒的免疫荧光方法检测  45-46
    3.4.2 pIL-12(p40)-linker-pIL-12(p35)基因真核表达质粒的免疫荧光方法检测  46-47
  3.5 小鼠脾脏及外周血T 淋巴细胞增殖功能动态变化  47-49
    3.5.1 小鼠脾脏T 淋巴细胞增殖功能动态变化  47-48
    3.5.2 小鼠外周血T 淋巴细胞增殖功能动态变化  48-49
  3.6 小鼠脾脏及外周血不同亚型T 淋巴细胞动态变化  49-54
    3.6.1 小鼠脾脏及外周血CD4~+T 淋巴细胞动态变化  49-52
    3.6.2 小鼠脾脏及血液CD8~+T 淋巴细胞动态变化  52-54
  3.7 小鼠外周血抗TGEV 51 IgG 抗体含量动态变化  54-55
  3.8 小鼠外周血IFN-γ和IL-4 的检测  55-56
  3.9 病毒中和试验检测小鼠血液中TGEV 的中和抗体  56-57
  3.10 免疫小鼠脾脏及外周血特异性细胞毒性T 淋巴细胞活性检测结果  57-59
4 讨论  59-67
  4.1 pIL-12、pIL-18 和TGEV 51 的免疫设计  59
  4.2 pIL-12 原核表达载体的构建及其在细菌中的表达  59-60
  4.3 真核表达载体的选择及真核重组质粒的构建  60-61
  4.4 真核表达载体重组质粒体外瞬时转染结果分析  61
  4.5 小鼠免疫后脾脏和外周血T 淋巴细胞的增殖效果  61-62
  4.6 小鼠免疫后脾脏和外周血CD4~+和CD8~+ T 淋巴细胞数量的动态变化  62-63
  4.7 小鼠免疫后抗TGEV S1 IgG 抗体含量动态变化  63
  4.8 小鼠免疫后IFN-γ和IL-4 的动态变化  63-64
  4.9 小鼠免疫后血液中TGEV 中和抗体含量分析  64-65
  4.10 小鼠免疫后脾脏及外周血特异性细胞毒性T 细胞活性  65-67
5.结论  67-68
致谢  68-69
参考文献  69-76
攻读硕士学位期间发表的学术论文  76

猪IL-12和IL-18对TGEV S基因核酸疫苗免疫效应的研究

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