学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

cAMP受体蛋白调控鼠疫耶尔森氏菌毒力的研究

作　者: 占玲俊
导　师: 秦川；杨瑞馥；周冬生
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 鼠疫耶尔森氏菌 转录调控 CRP 毒力基因pla pst and sycO-ypkA-yopJ
分类号: R516.8
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
下　载: 104次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


鼠疫是一种烈性自然疫源性疾病,人类历史上,曾经发生过3次鼠疫的世界性大流行。自上世纪90年代以来,鼠疫的发病呈上升趋势,2000年开始,世界卫生组织(WHO)将鼠疫列为重新抬头的传染病。另外,鼠疫菌是传统的生物性战剂之一,还是恐怖分子制造生物恐怖的首选微生物之一。鼠疫在中国的流行也很严峻,疫源地约占国土面积的15%,主要分布在我国的西北部,对人们的生命和财产造成巨大的威胁。鼠疫的病原菌是鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌),在自然界,鼠疫的主要宿主是啮齿动物,主要通过节肢动物蚤的叮咬在宿主之间传播。通过蚤叮咬或者其它途径,鼠疫可以传染给人,引发腺鼠疫、肺鼠疫和败血症鼠疫。鼠疫菌从鼠蚤传播到新的宿主过程中,经历了温度,渗透压,离子浓度,PH,氧等信号的改变,鼠疫菌必须适应相应的环境压力才能存活并维持其毒力和致病性,而每个适应性反应也必然伴随着鼠疫菌基因转录的改变,这体现在:很多特定的调控子,分别感应特定的外界信号,介导特定基因(包括毒力基因)表达的上调和下调,最终组成复杂的毒力调控网络,控制鼠疫菌在媒介和贮存宿主中生存能力和致病力。cAMP受体蛋白(cAMP receptor protein,CRP)作为细菌调控子能调控E.coli的100多个基因,包括参与分解代谢抑制的基因。在本实验中,我们构建了鼠疫菌201株的crp突变株(△crp)和回复株。通过体内外的毒力表型实验证实了CRP的毒力调控表型。利用比较芯片表达谱分析生长在TMH-1mM cAMP中的鼠疫菌201株和△crp的差异表达基因,根据E.coli CRP的基序的特点,用生物信息学的方法预测可能受CRP直接调控的靶基因38个,进一步用实时定量RT-PCR和EMSA(凝胶阻滞实验)来验证确定CRP的最小调控元。在此基础上,选取水平转移获得的毒力相关的质粒基因pla,pst和操纵子sycO-ypkA-yopJ进行精细调控机制的研究。通过体内的LacZ报告基因融合实验证明CRP对pla,pst和ypkA有直接调控作用,然后分别用引物延伸实验(Primer extension assay)和DNase I足迹实验(DNase I footprinting assay)确定上述毒力基因启动子区的转录起始位点,核心启动子元件和CRP结合位点序列,揭示上述基因的启动子区的结构图。表型实验显示crp的突变在体内和体外均影响突变株的生长,体外的生长曲线显示△crp的倍增时间长于WT,体内实验证明皮下途径感染时突变株的毒力比相应的野生株下降了15,000多倍,而静脉途径感染时,突变株的毒力大约下降了40倍。因此CRP是鼠疫菌毒力所必须的,并且在皮下感染途径中更重要。体内实验证实crp突变株的生长减慢可能是导致两种感染途径中突变株毒力减弱的部分原因。而相应的回复株能恢复crp缺失株的毒力表型,达到与野生株的毒力表型一致的水平。先前的实验证明由Pla编码的纤维蛋白酶原激活剂能特异性的促进鼠疫菌从外周感染部位(皮下感染[跳蚤叮咬]或者吸入)扩散。以上的实验证据都说明crp突变株中pla的表达缺失除了能降低体内的生长表型外,还能大大降低该突变株在皮下感染途径中的毒力。在本实验中,用鼠疫全基因组芯片采用双色荧光的比较芯片表达谱实验分析生长在TMH-1mM cAMP中的鼠疫菌田鼠型的野生株和△crp,筛选出278个差异表达基因,其中△crp相比于野生株(WT),有104个基因表达上调,174个下调。汇总E.coli CRP结合位点,用consensus-matrix和convert-matrix程序计算CRP结合序列每个位置四个碱基出现的权重,得到CRP结合序列的Matrix,进而用WebLogo软件展示序列logo,最终预测得到CRP结合box:TGTGA-N6-TCTCA。利用Matrix scan程序查找278个差异表达基因中的保守CRP基序,找到38个与基序匹配分值高(以8为界值)的基因作为候选可能受CRP直接调控的靶基因。后续的实时定量RT-PCR和凝胶阻滞实验(EMSA)显示有36个基因或者假定的操纵子受CRP直接调控,构成了鼠疫菌CRP的最小调控元,其中YPO2468的芯片表达谱结果与实时定量RT-PCR不一致,而yopD虽然芯片表达谱,实时定量RT-PCR,EMSA以及足迹实验都证实可能为CRP调控元,但引物延伸和lacZ报告基因融合实验并未发现CRP对yopD有直接调控作用,因此这两个基因不是CRP调控元。pla,pst和ypkA的lacZ融合实验证实CRP能正调控水平获得的质粒基因pla,pst,而负调控ypkA。通过引物延伸实验(Primer extension assay)和DNase I足迹实验(DNase I footprinting assay)定位了pla,pst和sycO-ypkA-yopJ操纵子的转录起始位点,核心启动子元件(-10和-35区)和CRP结合位点,三者一起揭示了CRP与pla,pst,sycO-ypkA-yopJ启动子DNA相互作用的结构图。pla,pst的CRP位点均位于启动子区-35区的上游,cAMP-CRP与启动子DNA结合后,促进RNA聚合酶的转录,表现为激活转录作用。鼠疫菌中的sycO,ypkA和yopJ基因组成一个三联体的操纵子,sycO-ypkA-yopJ操纵子上仅有一个受CRP调控的启动子,但是启动子上有2个CRP结合位点(位点1和位点2),并且只在位点1上找到CRP box的同源序列,说明位点1是真正的CRP位点,而位点2应该是无效位点。而sycO的CRP位点则位于-10区的下游,阻碍了RNA聚合酶的转录延伸,因此表现为抑制调控作用。无论是CRP蛋白还是pla,pst和sycO-ypkA-yqpJ启动子区,其在4种鼠疫菌生物型中,即古生型,中世纪型,东方型和田鼠型,是相当保守的。因此,本研究中的田鼠型鼠疫菌的结果可以普遍运用于其它鼠疫生物型中。通过上述实验,不仅首次界定了鼠疫菌田鼠型的CRP最小调控元,推测出CRP可能的调控元。结合相应的体内外表型实验,进一步证实并精细研究了CRP直接调控毒力基因pla,pst和sycO-ypkA-yopJ操纵子的机制。CRP毒力调控作用的确定,为鼠疫菌的药物的研制提供了新的靶点,必将对鼠疫的防治起重要的积极作用。

全文目录


目录  3-8
中文摘要  8-11
英文摘要  11-14
前言  14-26
  1.鼠疫的危害  14
  2.鼠疫菌的传播和治病过程  14-16
  3.鼠疫菌的病原学特征  16-19
    3.1 生理生化特性  16
    3.2 基因组的结构及整体调节  16
    3.3 毒力决定因子  16-19
      3.3.1 血浆酶原激活因子(Pla蛋白酶)  18
      3.3.2 鼠疫杆菌素Pst  18-19
      3.3.3 鼠疫菌的Ⅲ型分泌系统  19
  4.细菌基因表达调控  19-21
    4.1 细菌生物的基因调控特点  19
    4.2 细菌基因调控机制的类型与特点  19-20
    4.3 细菌的转录调控子与基因调控  20
    4.4 细菌毒力相关的转录调控子  20-21
  5.鼠疫菌的基因调控研究概况  21
  6.CRP的研究及进展  21-23
    6.1 降解物对基因活性的调节  21-22
    6.2 CAP的正性调控  22-23
    6.3 转录调控子CRP的研究进展  23
  7.本研究的目的与总体研究计划  23-26
正文  26-94
  1.材料  26-28
    1.1 菌株,质粒  26
      1.1.1 菌株  26
      1.1.2 质粒  26
    1.2 酶,试剂盒  26-27
    1.3 主要仪器  27-28
  2.方法  28-51
    2.1 △crp突变株的构建  28-30
      2.1.1 突变盒引物的设计与突变盒的扩增  28-29
      2.1.2 感受态细胞的制备  29
      2.1.3 电转化  29-30
      2.1.4 重组克隆的筛选鉴定  30
    2.2 △crp突变株的回复株C-crp的构建  30
    2.3 鼠疫菌毒力表型实验  30-31
      2.3.1 体外生长曲线  30
      2.3.2 动物实验LD50的测定  30-31
      2.3.3 鼠疫菌细菌的脏器分布  31
    2.4 芯片表达谱分析  31-34
      2.4.1 培养条件  31
      2.4.2 鼠疫菌总RNA的提取  31-32
        2.4.2.1 菌体收集和RNA固定  31
        2.4.2.2 菌体裂解  31
        2.4.2.3 沉淀核酸  31
        2.4.2.4 消化DNA  31-32
        2.4.2.5 沉淀RNA  32
      2.4.3 总RNA的荧光素标记  32-33
        2.4.3.1 逆转录生成氨基标记的cDNA  32-33
        2.4.3.2 氨基标记cDNA纯化  33
        2.4.3.3 氨基标记cDNA的荧光素标记与纯化  33
      2.4.4 芯片杂交及数据分析  33-34
        2.4.4.1 芯片的紫外交联与醛基封闭  33-34
        2.4.4.2 芯片的预杂交  34
        2.4.4.3 芯片杂交与漂洗  34
        2.4.4.4 数据分析  34
    2.5 Real-time PCR验证  34-36
      2.5.1 Trizol提取细菌RNA的方法  34-35
      2.5.2 Ambion's DNA-freeTM kit 去DNA污染  35
      2.5.3 逆转录  35
      2.5.4 Real-time PCR反应  35-36
        2.5.4.1 设计引物  36
        2.5.4.2 定量PCR  36
        2.5.4.3 绘制相对标准曲线和待测基因的定量PCR验证  36
    2.6 CRP结合位点的生物信息学预测  36-37
    2.7 acZ报告基因融合实验  37-41
      2.7.1 设计引物  37
      2.7.2 原理见下图6  37
      2.7.3 目的DNA扩增和产物纯化  37-38
      2.7.4 pRS551质粒DNA的提取  38
      2.7.5 启动子DNA和载体DNA的双酶切  38
      2.7.6 酶切产物的连接  38-39
      2.7.7 感受态制备  39
      2.7.8 转化  39
      2.7.9 重组克隆鉴定  39
      2.7.10 克隆片段DNA测序  39-40
      2.7.11 质粒DNA提取  40
      2.7.12 鼠疫菌电转化感受态细胞的制备  40
      2.7.13 电转化  40
      2.7.14 PCR鉴定  40-41
      2.7.15 LacZ酶活性检测  41
    2.8 his-CRP蛋白的表达与纯化  41-45
      2.8.1 引物设计及合成  41-42
      2.8.2 产物的扩增与连接  42
      2.8.3 连接产物转化感受态大肠杆菌BL21  42-43
      2.8.4 阳性克隆的挑选及目的蛋白的表达  43
      2.8.5 目的蛋白的表达纯化  43-44
        2.8.5.1 菌体培养和诱导  43-44
        2.8.5.2 Ni柱纯化  44
      2.8.6 透析和浓缩  44
      2.8.7 BCA法测定CRP蛋白浓度  44-45
    2.9.凝胶迁移实验  45-47
      2.9.1 目的DNA片段的合成  45
      2.9.2 探针的标记  45-46
      2.9.3 结合百分比的测定  46
      2.9.4 未结合标记物的去除  46
      2.9.5 结合反应  46-47
    2.10 DNA酶Ⅰ足迹实验  47-49
      2.10.1 放射性γ-~(32)P-ATP标记引物  47-48
      2.10.2 靶DNA的标记  48
      2.10.3 足迹试验步骤  48-49
    2.11 放射性γ-~(32)P-ATP标记引物及测序反应  49-50
      2.11.1 用放射性γ-~(32)P-ATP标记引物  49
      2.11.2 测序反应  49-50
    2.12 引物延伸实验  50-51
      2.12.1 与靶基因mRNA互补引物的设计  50
      2.12.2 总RNA的提取  50
      2.12.3 寡核苷酸探针的制备  50-51
      2.12.4 引物延伸反应  51
  3.结果  51-78
    3.1 △crp突变株及回复株-ccrP的构建  51-52
    3.2 毒力表型实验  52-55
      3.2.1 生长曲线  52
      3.2.2 LD50测定  52-53
      3.2.3 攻毒后小鼠生存率曲线  53-54
      3.2.4 细菌在脏器中分布  54-55
    3.3 CRP调控元  55-62
      3.3.1 芯片表达谱实验  55
      3.3.2 候选直接调控靶基因的预测  55-56
      3.3.3 实时定量RT-PCR  56-57
      3.3.4 his-CRP蛋白的表达纯化和浓度的测定  57-58
      3.3.5 凝胶阻滞实验  58-62
      3.3.6 小结  62
    3.4 CRP对关键毒力基因调控的精细机制  62-74
      3.4.1 sycO-ypkA-yopJ操纵子的验证  62-63
      3.4.2 lacZ融合实验  63-64
      3.4.3 足迹实验  64-67
      3.4.4 引物延伸实验  67-70
      3.4.5 靶基因启动子区的结构  70
      3.4.5 CPR依赖的pal,sPt以及syco-ypkA-yopJ划少即J的启动子区的结构  70-71
      3.4.6 小结  71-74
    3.5 CRP基序的生物信息学分析  74-78
      3.5.1 CRP Box  74-75
      3.5.2 CRP Matrix  75
      3.5.3 全基因组生物信息学预测  75-78
  4.讨论  78-92
    4.1 CRP是一个整体调控子  78-79
    4.2 CRP能激活两个水平转移获得的质粒pPCP1上的基因pla和pst  79
    4.3 CRP和sycO-ypkA-yopJ操纵子  79
    4.4 Y.pestis中的CRP是一个毒力调控子  79-80
    4.5 CRP调控机制的小结  80-92
  5.结语  92-94
参考文献  94-97
附录  97-109
  1.药品,溶液,药品,配制方法  97-105
  2.本研究中所用到的引物  105-108
  3.缩略语  108-109
致谢  109-111
攻博期间主要学术成果  111-112

相似论文

  1. 多转录因子组合调控研究,Q78
  2. 霍乱弧菌LysR/MFS调控体系的功能研究,R378
  3. 梨火疫病菌致病相关基因crp与tatC的克隆及功能分析,S436.612
  4. 霍乱弧菌LysR家族基因vc2103的功能及其调控基因的研究,R346
  5. 豆蔻酰化修饰及质膜结合在烟草小GTP结合蛋白基因NtRab5b转录调控中的作用,Q943
  6. 透析方式和透析时间对慢性肾功能衰竭患者CRP的影响,R692.5
  7. 不稳定性心绞痛合并代谢综合征患者血清sCD40L水平及其与冠状动脉病变的关系,R589
  8. 射频消融术引起心肌损伤的临床评价及比较普通射频消融导管与冷盐水灌注射频消融导管对心肌损伤的影响,R541.7
  9. 曲古抑菌素A（TSA）在IFN-γ调控TRIM22表达中的作用及其机制研究,R346
  10. 动脉粥样硬化模型大鼠ADP与炎性因子表达及中药对其调控的机制研究,R285
  11. 隔姜蒜督灸治疗强直性脊柱炎寒湿痹阻证及对ESR、CRP影响的研究,R246
  12. 转录因子Pax3对胶质纤维酸性蛋白基因的负性转录调控研究,Q42
  13. 人KCTD10基因启动子及其调控研究,Q987
  14. 阿托伐他汀对大鼠高血压脑出血治疗作用机制的实验研究,R965
  15. APE1基因遗传变异与宫颈癌发生风险及其机制探讨,R737.33
  16. 蛋白激酶NUAK1的定位及其与NF-kB信号通路关系的探讨,R730.2
  17. IL-6-174G/C和CRP+1059G/C基因多态性与新疆哈萨克族及汉族代谢综合征的相关性研究,R589
  18. 血清hs-CRP和SP-D的检测对于COPD急性加重期患者的临床意义,R563.9
  19. 血浆抗H441细胞抗体水平在稳定期COPD升高并与吸烟者系统性炎症因子水平相关,R563.9
  20. 心脑通络液对局灶性脑缺血急性期大鼠血浆UA和CRP含量的影响,R285.5
  21. 小陷胸汤加味方对兔心肌缺血再灌注损伤MPO、TNF-α和CRP的干预,R285.5

中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 传染病 > 杆菌传染病 > 鼠疫
© 2012 www.xueweilunwen.com