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迟缓爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统（T3SS）输送器蛋白及分子伴侣的研究

作　者: 王波
导　师: 张培军；莫照兰
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 海洋生物学
关键词: 迟缓爱德华氏菌 致病机理 III型分泌系统 输送器蛋白 分子伴侣 EscA EseC 框内缺失突变 蛋白表达 EseD
分类号: S941
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
下　载: 212次
引　用: 2次
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内容摘要


迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是重要的革兰氏阴性致病菌,可以感染包括人类在内的多种动物。由迟缓爱德华氏菌引发的爱德华氏菌病已经在许多水产养殖动物中被发现,每年给淡水和海水水产养殖业带来巨大的损失。目前为止对于迟缓爱德华氏菌病的防治以化学治疗为主,疫苗的研究还在进行中。III型分泌系统(T3SS)是E. tarda重要的致病因子,虽然T3SS基因簇的结构及部分基因的功能得到了初步研究,但其作用机制还未得到阐明。本研究着重开展了迟缓爱德华氏菌T3SS输送器蛋白EseC的分子伴侣的鉴定及功能研究,并对输送器蛋白及其免疫功能进行了初步探讨,希望进一步地了解T3SS在E. tarda致病中的功能及其在疫苗研制中的作用。一、迟缓爱德华氏菌III型分泌系统(T3SS)输送器蛋白EseC分子伴侣的鉴定和功能研究以前的工作表明,EseB、EseC和EseD蛋白是E. tarda T3SS输送器蛋白的组成成分,在分泌到细菌细胞外后可以组成输送器装置。分子伴侣对于输送器蛋白的稳定和分泌具有重要的作用,EscC已经被鉴定为EseB和EseD的分子伴侣,而EseC的分子伴侣还没有得到鉴定。在本实验中,我们以EseC作为研究对象,主要开展了EseC分子伴侣鉴定的研究。生物信息学分析表明,在E. tarda T3SS基因簇上的escA基因与eseC相邻,其编码的蛋白形成一个大的螺旋结构,为分子量较小(17.5kD)的酸性蛋白(pI 4.79),并与已鉴定的分子伴侣具有序列的同源性,这些符合细菌T3SS分子伴侣的特征。研究发现,EscA蛋白分布在细菌的细胞质和细胞膜上。在escA基因缺失后,大大降低了EseC分泌到细菌细胞外的量,同时EseC蛋白在细菌细胞质中的积聚量也减少,当escA基因缺失突变株得到escA基因互补后,EseC的分泌和在细胞质内的积聚恢复到了野生型菌株水平。氯霉素阻断蛋白质合成的实验发现,当细菌不表达EscA的情况下,EseC蛋白逐渐降解,说明了EscA可以影响EseC在胞质中的稳定。蛋白体外结合试验和免疫共沉淀实验发现,EseC和EscA在体外可以结合,在细菌细胞质中也可以相互结合,表明EseC和EscA可以相互作用。上述结果表明,EscA是EseC的分子伴侣。在确定了EscA是EseC的分子伴侣之后,我们进一步确定EscA对EseC表达的影响,以及两者相互作用的结构域。通过检测转录水平和翻译水平的EseC-LacZ融合蛋白表达情况,发现在EscA缺失的情况下,EseC的转录水平没有变化,而翻译水平下降,表明EscA对EseC的影响在转录后水平。通过构建含有部分结构域缺失的escA或eseC的体外共表达体系,并进行Western blot分析,确定了EseC的31-137氨基酸序列为与EscA结合的区域,而在EscA中并没有找到与EseC结合的区域。EseC的31-137氨基酸片段缺失后,EseC的分泌和在E. tarda细菌细胞中的积聚下降,其下降幅度与escA突变株相当,进一步表明EseC的31-137氨基酸为与EscA相互作用的区域。最后人工感染实验表明,分子伴侣EscA及其与EseC的相互作用对E. tarda的致病力有影响。二、迟缓爱德华氏菌T3SS输送器蛋白的研究一些研究表明,T3SS在细菌与宿主相互作用的过程中表达,在体外诱导的条件下也可表达。为了确定E. tarda T3SS体外诱导表达的条件,我们检测了不同培养温度、pH条件下,E. tarda T3SS输送器蛋白表达的情况。研究表明,37°C条件下,E. tarda生长快,T3SS的输送器蛋白表达较低;28°C条件下,T3SS的输送器蛋白表达最高,而在20°C条件下,没有检测到T3SS输送器蛋白的表达。在28°C和37°C的培养条件下,中性和碱性相对酸性来说适合细菌的生长和T3SS输送器蛋白的表达。我们分析了E. tarda野生型和输送器蛋白突变株中的输送器蛋白的细胞分布,并据此推测输送器形成的机制。单一输送器蛋白的缺失不影响其它两个输送器蛋白的积聚,而输送器蛋白的分泌之间存在一定的相互影响。通过检测输送器蛋白突变株?eseB, ?eseC, ?eseD生长、泳动、自凝聚和溶血能力的变化,发现在输送器蛋白基因缺失后,体外培养的E. tarda的生长速度变慢,泳动、自凝聚和溶血能力也变弱,说明了输送器蛋白在细菌的生长和功能行使中的重要作用。为了检测输送器蛋白的免疫保护效果,我们克隆了eseD基因,将其在表达菌株BL21(DE3)中进行表达,并将重组表达的EseD蛋白经Ni-NTA树脂进行纯化。以EseD纯化蛋白作为蛋白抗原对大菱鲆进行注射,EseD蛋白表现出了对鱼类的免疫原性,其抗体效价在第7周达到了最高,为1:5120。攻毒实验表明该蛋白对于保护大菱鲆免疫E. tarda的感染具有帮助作用,在105cfu攻毒浓度下大菱鲆的相对存活率(RPS)为62.5%。结果说明EseD蛋白可以作为蛋白抗原疫苗的候选,并能够在保护鱼类免疫爱德华氏菌病中发挥作用。

全文目录


摘要  6-9
ABSTRACT  9-16
引言  16-19
第一章 文献综述  19-51
  第一节 迟缓爱德华氏菌概述  19-23
    1.1.1 分类地位  19-20
    1.1.2 疾病感染  20-22
    1.1.3 分布和流行特征  22-23
  第二节 迟缓爱德华氏菌的致病机制  23-46
    1.2.1 黏附和侵袭  23-25
    1.2.2 抗宿主免疫机制  25-26
    1.2.3 分泌毒素和酶类  26-27
    1.2.4 铁摄取  27
    1.2.5 寡肽透过酶  27
    1.2.6 群体效应  27-28
    1.2.7 分泌系统  28-46
      1.2.7.1 细菌分泌系统简介  28-41
      1.2.7.2 E. tarda T3SS 研究进展  41-45
      1.2.7.3 E. tarda T6SS 研究进展  45-46
  第三节 迟缓爱德华氏菌的防治  46-51
    1.3.1 化学治疗  46
    1.3.2 疫苗防治  46
    1.3.3 疫苗的来源  46-48
    1.3.4 疫苗的给予方式  48
    1.3.5 疫苗研究进展  48-51
第二章 迟缓爱德华氏菌 III 型分泌系统输送器蛋白 EseC 的分子伴侣的鉴定和功能研究  51-117
  第一节 分子伴侣缺失突变株的构建和胞外分泌蛋白的检测  53-62
    2.1.1 材料和方法  53-58
      2.1.1.1 菌株和质粒  53-55
      2.1.1.2 生物信息学分析和确定待定分子伴侣  55
      2.1.1.3 待定分子伴侣基因缺失突变株的构建  55-58
      2.1.1.4 E. tarda 细胞胞外分泌蛋白的提取  58
    2.1.2 实验结果  58-60
      2.1.2.1 生物信息学分析结果  58-59
      2.1.2.2 待定分子伴侣基因的确定  59-60
    2.1.3 小结和讨论  60-62
  第二节 待定分子伴侣EscA 的克隆、表达、纯化和兔抗血清的制备  62-77
    2.2.1 材料和方法  62-73
      2.2.1.1 菌株和材料  62-63
      2.2.1.2 escA 基因的克隆  63-66
      2.2.1.3 原核重组表达  66-67
      2.2.1.4 SDS-PAGE  67-68
      2.2.1.5 蛋白纯化方法  68-69
      2.2.1.6 蛋白浓度的测定  69-70
      2.2.1.7 兔抗血清的制备  70-72
      2.2.1.8 间接Elisa 实验  72-73
    2.2.2 实验结果  73-76
      2.2.2.1 escA 的克隆  73
      2.2.2.2 EscA 的表达  73-74
      2.2.2.3 EscA 的纯化  74-75
      2.2.2.4 EscA 纯化蛋白的浓度  75
      2.2.2.5 EscA 血清的效价  75-76
    2.2.3 小结和讨论  76-77
  第三节 分子伴侣EscA 的细胞定位及其对EseC 的分泌、表达和稳定性的影响  77-86
    2.3.1 材料和方法  77-81
      2.3.1.1 材料  77
      2.3.1.2 E. tarda 细胞蛋白组分的提取  77-78
      2.3.1.3 体外不同培养时间EseC 的表达的检测  78-79
      2.3.1.4 氯霉素对蛋白合成的阻断实验  79
      2.3.1.5 Western blot 分析蛋白的分泌和表达  79-80
      2.3.1.6 蛋白含量分析和测定  80-81
    2.3.2 实验结果  81-84
      2.3.2.1 EscA 在E. tarda 细菌细胞上的定位  81
      2.3.2.2 EscA 的缺失影响EseC 的分泌  81-82
      2.3.2.3 EscA 的缺失影响EseC 的表达  82-83
      2.3.2.4 EscA 的缺失影响EseC 的稳定性  83-84
    2.3.3 小结和讨论  84-86
  第四节 EscA 与EseC 相互作用的研究  86-93
    2.4.1 材料和方法  86-88
      2.4.1.1 菌株和质粒  86
      2.4.1.2 共表达载体的构建  86-87
      2.4.1.3 EscA 与EseC 蛋白的共表达  87
      2.4.1.4 EscA 与EseC 蛋白的体外结合实验  87-88
      2.4.1.5 EscA 与EseC 蛋白的体内结合实验  88
    2.4.2 实验结果  88-91
      2.4.2.1 共表达载体的构建  88-90
      2.4.2.2 EscA 和EseC 的体外共表达  90
      2.4.2.3 EscA 和EseC 在体外相互作用  90-91
      2.4.2.4 EscA 和EseC 在体内相互作用  91
    2.4.3 小结和讨论  91-93
  第五节 EscA 对EseC 表达的影响  93-103
    2.5.1 材料和方法  93-98
      2.5.1.1 菌株和质粒  93-94
      2.5.1.2 EseC-LacZ 表达载体的构建  94-95
      2.5.1.3 接合实验  95-97
      2.5.1.4 β-半乳糖苷酶活性测定  97-98
    2.5.2 实验结果  98-101
      2.5.2.1 LacZ 载体的构建  98-100
      2.5.2.2 EscA 对EseC 表达的影响  100-101
    2.5.3 小结和讨论  101-103
  第六节 EscA 和EseC 相互作用区域的确定  103-114
    2.6.1 材料和方法  103-108
      2.6.1.1 菌株和质粒  103-104
      2.6.1.2 生物信息学分析  104-105
      2.6.1.3 基因缺失的共表达载体的构建  105-107
      2.6.1.4 体外共表达和蛋白结合实验  107-108
      2.6.1.5 E. tarda △eseC31-137 缺失株的构建  108
    2.6.2 实验结果  108-112
      2.6.2.1 EscA 和EseC 功能结构域的确定  108-109
      2.6.2.2 EscA 和EseC 基因缺失片段共表达载体的构建  109
      2.6.2.3 与EseC 作用的EscA 结构域  109-110
      2.6.2.4 与EscA 作用的EseC 结构域  110-111
      2.6.2.5 E. tarda △eseC31-137 缺失株对EseC 蛋白分泌和表达的影响  111-112
    2.6.3 小结和讨论  112-114
  第七节 分子伴侣EscA 对迟缓爱德华氏菌致病力的影响  114-117
    2.7.1 材料和方法  114-115
      2.7.1.1 材料  114
      2.7.1.2 测定菌株对蓝曼龙LD50 的实验  114-115
    2.7.2 实验结果  115
    2.7.3 小结和讨论  115-117
第三章 迟缓爱德华氏菌 T3SS 输送器蛋白的研究  117-139
  第一节 迟缓爱德华氏菌T355 输送器蛋白体外诱导表达的研究  118-123
    3.1.1 材料和方法  118-119
      3.1.1.1 菌株和材料  118
      3.1.1.2 T3SS 诱导条件摸索  118
      3.1.1.3 细胞组分蛋白提取  118-119
    3.1.2 实验结果  119-121
      3.1.2.1 T3SS 输送器蛋白体外诱导表达条件的优化  119-120
      3.1.2.2 T3SS 输送器蛋白的表达分布  120
      3.1.2.3 △eseB, △eseC, △eseD 中输送器蛋白的表达和分泌  120-121
    3.1.3 小结与讨论  121-123
  第二节 迟缓爱德华氏菌T3SS 输送器蛋白突变株的表型研究  123-129
    3.2.1 材料和方法  123-124
      3.2.1.1 菌株和材料  123
      3.2.1.2 生长曲线测定  123
      3.2.1.3 细菌泳动实验  123
      3.2.1.4 细菌溶血实验  123-124
    3.2.2 实验结果  124-127
      3.2.2.1 △eseB, △eseC, △eseD 的生长状况  124-125
      3.2.2.2 △eseB, △eseC, △eseD 的泳动能力  125-126
      3.2.2.3 △eseB, △eseC, △eseD 的自凝聚  126-127
      3.2.2.4 △eseB, △eseC, △eseD 的溶血能力  127
    3.2.3 小结与讨论  127-129
  第三节 迟缓爱德华氏菌T3SS 输送器蛋白EseD 对鱼的免疫效果研究  129-139
    3.3.1 材料和方法  129-133
      3.3.1.1 菌株和材料  129
      3.3.1.2 重组表达载体的构建  129-130
      3.3.1.3 重组蛋白的表达  130
      3.3.1.4 EseD 蛋白的纯化  130-131
      3.3.1.5 EseD 鼠抗血清的制备  131
      3.3.1.6 EseD 蛋白对大菱鲆的免疫原性测定  131-132
      3.3.1.7 间接Elisa 实验测血清效价  132
      3.3.1.8 EseD 对大菱鲆的免疫保护实验  132-133
      3.3.1.9 数据统计  133
    3.3.2 实验结果  133-137
      3.3.2.1 eseD 基因的克隆  133-134
      3.3.2.2 eseD 基因的表达和纯化  134
      3.3.2.3 EseD 鼠抗血清的制备  134-135
      3.3.2.4 EseD 蛋白免疫大菱鲆的血清效价  135-136
      3.3.2.5 EseD 蛋白对大菱鲆的免疫保护  136-137
    3.3.3 小结与讨论  137-139
第四章 结论  139-142
参考文献  142-158
发表文章  158-160
致谢  160

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 鱼病学
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