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角毛壳菌Chi58基因克隆与密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达

作　者: 王艳君
导　师: 杨谦
学　校: 哈尔滨工业大学
专　业: 环境科学与工程
关键词: 角毛壳菌几丁质酶密码子优化几丁质结合域生物防治
分类号: S476.1
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

角毛壳菌(Chaetomium cupreum Ames)是一种优良的生物防治真菌,能有效防治多种植物病原菌引起的病害;几丁质酶是其生防过程中产生并发挥重要作用的细胞壁水解酶类。以角毛壳菌(C. cupreum)几丁质酶为研究对象,构建高效表达几丁质酶的基因工程菌株;并通过密码子改造、多拷贝整合转化子的筛选、发酵条件优化等方法提高了几丁质酶基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)系统中的表达量。为几丁质酶工业化生产提供优良的基因工程菌株,为研究和开发新型生物农药奠定坚实的基础。在模拟自然环境条件下,分别以3种植物病原真菌细胞壁诱导角毛壳菌(C. cupreum)细胞壁水解酶类的产生;半定量RT-PCR分析表明,几丁质酶Chi58基因被诱导表达,推测几丁质酶Chi58基因可能是角毛壳菌(C. cupreum)几丁质酶系的一个重要组分并参与角毛壳菌(C. cupreum)的生物防治作用。因此,本文通过反向PCR方法克隆了几丁质酶基因Chi58全长序列,为角毛壳菌(C. cupreum)的生物防治机理的研究奠定基础。Chi58基因已成功注册到GenBank数据库(登录号为:DQ886936),经生物信息学分析表明,CHI58包含1个N端信号肽序列、1个几丁质结合区(ChBD)、富含半胱氨酸的连接区及糖基水解酶18家族催化区结构域。ChBD与植物几丁质酶中ChBD的位置及氨基酸组成相似,同属于ClassI几丁质结合域类型。构建载体pYES2-Chi58和pPIC9K-Chi58分别转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)H158及毕赤酵母(P. pastoris)GS115。经酶活性测定表明,在酿酒酵母(S. cerevisiae)表达系统中,几丁质酶活性在诱导后第60h达到最高值,酶活为0.33U;而在毕赤酵母(P. pastoris)中酶活最高值为39U,出现在诱导后第120h,酶活性较酿酒酵母(S. cerevisiae)提高约120倍。SDS-PAGE及Zymogram验证了几丁质酶CHI58被分泌到毕赤酵母(P. pastoris)细胞外大量表达,且具有几丁质酶活性。发酵液中几丁质酶酶促反应最适温度为45℃;最适pH值为5.8;在70℃下具有较好的热稳定性;转化子经10代传代培养后仍具有较高的几丁质酶活性。几丁质酶对可溶性底物(乙二醇几丁质)及不溶性底物(胶态几丁质、粉末几丁质、羧甲基壳聚糖)降解作用不同,不能降解可溶性的乙二醇壳聚糖。金属离子及化合物可以影响几丁质酶的活性,其中Ba2+和NH4+对几丁质酶活性的影响最大,使酶活性分别提高了171.2%和80%;而Mg2+和K+使酶活性分别提高了21.2%和24.4%;其它金属离子及化合物对几丁质酶均具有抑制作用,其中Ca2+、Mn2+和NaN3对酶活的抑制作用最弱。分析影响CHI58在毕赤酵母(P. pastoris)中表达量的内、外因素表明,密码子改造是提高外源基因表达量的最直接有效地方法。将Chi58基因中相距较近的5个编码精氨酸的密码子CGC突变为毕赤酵母(P. pastoris)使用频率较高的AGA后,Chi58在毕赤酵母(P. pastoris)中的表达量提高了约3倍。经密码子改造、多拷贝整合筛选、发酵条件优化后,CHI58的酶活值最高达246.68U,为初始几丁质酶活性的6倍。通过SOE-PCR方法获得了几丁质结合域(ChBD)缺失突变体,将缺失突变体在毕赤酵母(P. pastoris)中进行表达,结果表明,ChBD的存在对不溶性几丁质的绑定和吸附具有重要的作用。将缺失突变体的转化子发酵液浓缩10倍进行体外抑菌试验,发酵液对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、杨树叶枯病菌(Septoria tritici)及稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)具有不同程度的抑制作用,但抑制率较低,最高抑菌率仅为15%;而Chi58的转化子发酵液浓缩10倍后,最高抑菌率可达40%。由此说明,缺失几丁质结合域的几丁质酶对植物病原菌的抑制作用明显降低,几丁质结合域的存在对几丁质酶的生物防治作用具有重要意义。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-17
第1章绪论  17-40
  1.1 课题背景及研究的目的和意义  17-18
  1.2 国内外研究综述  18-38
    1.2.1 生物农药的研究进展  18-21
    1.2.2 毛壳菌生防能力的研究现状及意义  21-25
    1.2.3 几丁质酶分类及酶学特性研究进展  25-29
    1.2.4 酵母表达系统的研究概况  29-34
    1.2.5 影响外源基因在毕赤酵母系统中高效表达的因素  34-38
  1.3 存在的问题  38-39
  1.4 课题的来源及主要研究内容  39-40
    1.4.1 课题来源  39
    1.4.2 主要研究内容  39-40
第2章实验材料与方法  40-65
  2.1 实验材料  40-45
    2.1.1 菌株和质粒  40
    2.1.2 培养基  40-42
    2.1.3 酶和试剂  42-44
    2.1.4 仪器设备  44-45
  2.2 实验方法  45-65
    2.2.1 角毛壳菌几丁质酶Chi58 基因的诱导表达  45-46
    2.2.2 角毛壳菌几丁质酶Chi58 基因克隆及序列分析  46-49
    2.2.3 酿酒酵母表达载体的构建与鉴定  49-51
    2.2.4 毕赤酵母表达载体的构建与鉴定  51-53
    2.2.5 Chi58 基因密码子改造突变体的构建  53-55
    2.2.6 Chi58 基因多拷贝整合转化子的获得  55-56
    2.2.7 Chi58 基因几丁质结合域缺失突变体的构建  56-58
    2.2.8 重组几丁质酶活性测定及酶学特性分析  58-61
    2.2.9 重组几丁质酶SDS-PAGE 及酶谱分析  61-62
    2.2.10 重组几丁质酶的诱导表达及发酵条件优化  62-63
    2.2.11 重组几丁质酶转化子与病原菌的室内拮抗试验  63-65
第3章角毛壳菌几丁质酶Chi58 基因的克隆及序列分析  65-79
  3.1 角毛壳菌几丁质酶的诱导表达  65-66
    3.1.1 不同碳源对角毛壳菌几丁质酶的诱导表达  65-66
    3.1.2 半定量RT-PCR 分析Chi58 基因的表达量  66
  3.2 Chi58 基因全长序列获得及生物信息学分析  66-76
    3.2.1 Chi58 基因全长DNA 序列的获得  66-69
    3.2.2 Chi58 基因序列同源性比对及保守区预测  69-70
    3.2.3 CHI58 氨基酸组成分析  70-71
    3.2.4 CHI58 信号肽预测  71-72
    3.2.5 CHI58 多序列比对  72-74
    3.2.6 CHI58 氨基酸结构域预测  74-75
    3.2.7 CHI58 系统进化树的构建  75-76
  3.3 Chi58 基因的诱导表达与序列分析的讨论  76-77
    3.3.1 几丁质酶与生物防治  76
    3.3.2 应用反向PCR 方法获得全长DNA 序列  76-77
    3.3.3 几丁质酶基因及推导氨基酸序列的生物信息学分析  77
  3.4 本章小结  77-79
第4章角毛壳菌几丁质酶Chi58 基因在酵母系统中的表达研究  79-94
  4.1 几丁质酶Chi58 基因的酿酒酵母转化及表达  79-82
    4.1.1 几丁质酶 Chi58 基因的扩增及与 pYES2 载体的连接  79-80
    4.1.2 酿酒酵母 H158 的生长曲线测定  80-81
    4.1.3 几丁质酶基因Chi58 的酿酒酵母转化及鉴定  81
    4.1.4 酿酒酵母转化子几丁质酶活性检测  81-82
  4.2 几丁质酶Chi58 基因的毕赤酵母转化及表达  82-88
    4.2.1 几丁质酶Chi58 的扩增及表达载体的构建  82-83
    4.2.2 几丁质酶Chi58 基因在毕赤酵母中的转化  83-84
    4.2.3 转化子产酶最适pH 值的测定  84
    4.2.4 转化子最适发酵时间的测定  84-85
    4.2.5 转化子产酶最适温度的测定  85
    4.2.6 转化子产酶热稳定性的测定  85-86
    4.2.7 不同底物对几丁质酶活性的影响  86
    4.2.8 不同金属离子及化合物对几丁质酶活性的影响  86-87
    4.2.9 转化子遗传稳定性分析  87
    4.2.10 SDS-PAGE 及酶谱鉴定  87-88
  4.3 几丁质酶CHI58 酶学特性及表达分析  88-93
    4.3.1 几丁质酶CHI58 在两种酵母系统中的表达分析  88-89
    4.3.2 载体构建及毕赤酵母转化  89-90
    4.3.3 几丁质酶CHI58 酶学特性分析  90-92
    4.3.4 酶谱分析及蛋白活性电泳  92-93
  4.4 本章小结  93-94
第5章几丁质酶Chi58 基因在毕赤酵母中的高效表达研究  94-116
  5.1 几丁质酶Chi58 基因密码子改造的研究  94-103
    5.1.1 毕赤酵母表达系统对外源基因密码子选择的偏爱性  94-95
    5.1.2 几丁质酶Chi58 基因密码子使用分析  95-97
    5.1.3 几丁质酶CHI58A 三级结构分析  97-98
    5.1.4 几丁质酶基因Chi58A 的密码子改造及鉴定  98-99
    5.1.5 毕赤酵母表达载体的构建  99-100
    5.1.6 电转化毕赤酵母 GS115 及转化子的筛选  100-101
    5.1.7 几丁质酶活性的比较分析  101-102
    5.1.8 SDS-PAGE 比较分析  102
    5.1.9 重组酵母的遗传稳定性分析  102-103
  5.2 几丁质酶Chi58 基因多拷贝整合的研究  103-105
    5.2.1 G418 筛选不同拷贝数的转化子  103-104
    5.2.2 几丁质酶Chi58 基因的二次转化  104-105
  5.3 发酵条件优化  105-109
    5.3.1 菌体初始接种量对几丁质酶表达量的影响  105-106
    5.3.2 不同pH 值对外源蛋白表达的影响  106-107
    5.3.3 诱导阶段甲醇浓度对蛋白表达量的影响  107
    5.3.4 油酸对蛋白表达量的影响  107-108
    5.3.5 正交设计法优化培养基配方试验  108-109
  5.4 几丁质酶Chi58 基因高效表达的讨论  109-115
    5.4.1 密码子选择的偏爱性对几丁质酶 CHI58 表达量的影响  109-110
    5.4.2 SOE-PCR 方法在密码子改造中的应用  110-112
    5.4.3 几丁质酶Chi58 基因多拷贝整合对表达量的影响  112
    5.4.3 几丁质酶 Chi58 基因多拷贝整合对表达量的影响  112-115
  5.5 本章小结  115-116
第6章几丁质酶Chi58 基因结构域的功能验证及抑菌效能研究  116-136
  6.1 几丁质酶 CHI58 分子结构预测  116-119
    6.1.1 CHI58 结构域预测  116-117
    6.1.2 CHI58 二级结构预测  117-118
    6.1.3 CHI58D 三级结构预测  118-119
  6.2 ChBD 缺失突变体的构建及在毕赤酵母中的转化  119-122
    6.2.1 结构域缺失突变体的构建  119-120
    6.2.2 结构域缺失突变体Chi58D 表达载体的构建  120
    6.2.3 转化毕赤酵母及其表型鉴定  120-121
    6.2.4 SDS-PAGE 比较分析  121-122
  6.3 转化子的几丁质酶活性检测  122-125
    6.3.1 基于可溶性底物的几丁质酶活性检测  122-123
    6.3.2 基于不溶性底物的几丁质酶活性检测  123
    6.3.3 以真菌细胞壁为底物的几丁质酶活性检测  123-124
    6.3.4 CHI58 与 CHI58D 最适温度与最适 pH 值的比较  124-125
  6.4 基因工程菌株发酵液对植物病原菌的抑制作用  125-127
    6.4.1 应用含毒介质法测定抑菌效果的研究  125-126
    6.4.2 应用平板打孔法测定抑菌效果的研究  126-127
  6.5 角毛壳菌与植物病原菌的室内拮抗试验  127-131
    6.5.1 角毛壳菌对立枯丝核菌的拮抗作用  127-128
    6.5.2 角毛壳菌对杨树叶枯病菌的拮抗作用  128-129
    6.5.3 角毛壳菌对核盘菌的拮抗作用  129
    6.5.4 角毛壳菌对杨树烂皮病菌的拮抗作用  129-130
    6.5.5 角毛壳菌对尖孢镰刀菌的拮抗作用  130-131
  6.6 几丁质酶基因结构域及其抑菌活性分析  131-135
    6.6.1 几丁质酶几丁质结合域分析  131-133
    6.6.2 几丁质酶抑菌活性分析  133-135
  6.7 本章小结  135-136
结论  136-138
参考文献  138-155
攻读博士学位期间发表的论文及其它成果  155-157
致谢  157-158
个人简历  158

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