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大鼠再生肝中星形细胞的基因表达谱分析

作　者: 常翠芳
导　师: 徐存拴；张富春
学　校: 新疆大学
专　业: 动物学
关键词: 肝再生部分肝切除星形细胞 Rat Genome 230 2.0芯片肝再生相关基因
分类号: Q75
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

肝脏是人体的重要器官,其强大的再生能力亦为学者重视。通常,人们用Higgins和Anderson建立的大鼠2/3肝切除模型(partial hepatectomy,PH)和肝组织材料研究肝再生(liver regeneration,LR)机理,但肝脏由多种细胞组成,若将再生肝的各种细胞分离出来分别进行研究,将会使研究更加明晰、简化和易行。肝星形细胞(hepatic stellate cells,HSCs)是肝脏特有的间充质细胞,位于肝索与肝窦壁之间的Disse间隙中,表面突起附于窦内皮细胞外表面及肝细胞表面,内含粗面内质网、Golgi复合体及许多大小不一的脂滴,具有维生素A储存和运输功能;脂肪吸收功能;参与肝细胞、肝脏损伤应答和修复;是一种专职抗原递呈细胞,能吞噬凋亡小体,参与肝免疫炎症调节;是肝内胞外基质和趋化因子等细胞因子主要的分泌细胞。大量证据表明星形细胞在肝再生中起关键作用。近来尽管有关星形细胞的研究报道越来越多,但在基因组范围内研究肝再生中星形细胞生理活动变化的并不多。另外,在基因组范围内研究星形细胞的新技术虽然不断涌现,但目前对星形细胞在肝再生中作用的认识主要来自传统的研究方法。因此若能检测它们在肝再生的动态表达谱,就有可能揭示星形细胞在肝再生中的作用机制。本文按Higgins等方法制作大鼠2/3肝切除模型,用两步灌流法分散肝脏细胞,用60%的Percoll密度梯度离心和免疫磁珠分离肝星形细胞,用结蛋白(desmin,DES)和波形蛋白(vimentin,VIM)的免疫组织化学方法定位、定性再生肝(regenerating liver,RL)和分散肝脏细胞中的肝星形细胞及分离的肝星形细胞,用RT-PCR定量肝星形细胞的DES和VIM mRNA,用蛋白免疫印迹方法定量肝星形细胞的DES和VIM蛋白。初步证实,分离的肝星形细胞中DES和VIM阳性细胞占95%以上,从PH后各时间点分离的肝星形细胞的DES和VIM mRNA量稳定,相应的蛋白量亦稳定。用Rat Genome 230 2.0芯片检测大鼠2/3肝切除后恢复0、2、6、12、24、30、36、72、120、168h等10个时间点的大鼠再生肝星形细胞的基因表达谱,用RT-PCR和免疫印迹方法检验了芯片检测结果的可靠性,用生物信息学和系统生物学等方法分析它们在大鼠肝再生中的表达变化。结果表明2609个基因与肝再生相关,包括1186个表达上调、1212个表达下调和211个表达上/下调基因。PCA分析它们在PH后不同时点星形细胞的基因转录谱特征表明,9个时间点的基因表达谱明显的聚集均为三组,即6、24和30h,2、12和36h,72、120和168h,且主要在2、12和36h组表达上调。为探讨1183个新基因在肝再生中作用,本研究首先通过电子克隆和ORF finder序列分析工具预测它们编码的氨基酸序列,发现其中的936个新基因有相应的蛋白。将它们与本实验室建立的大鼠蛋白质亚细胞定位数据集中的蛋白序列比对,以预测它们的亚细胞位置。结果发现,大部分基因编码产物定位在细胞基质、细胞核、细胞质膜和线粒体中。协同作用分析1426个已知基因涉及的60类生理活动在再生肝星形细胞中的变化表明,跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、细胞建成、细胞生长、细胞分化、细胞凋亡、糖类分解等活动在肝再生启动阶段增强,SMO信号通路、核酸分解、糖类合成、蛋白质分解、胶原合成、神经递质运输、有机酸运输、离子运输等活动在肝再生进展阶段增强,蛋白激酶信号通路、细胞增殖、辅因子分解等活动在肝再生终止阶段增强,脂类运输、跨膜运输等活动在肝再生启动和进展阶段增强;而细胞粘附、细胞因子合成等活动在肝再生进展阶段减弱,免疫反应激活的信号通路、一氧化氮介导的信号通路、氨基酸及其衍生物合成、脂类运输、神经递质运输、氧运输在肝再生终止阶段减弱,一氧化氮介导的信号通路、小GTP酶介导的信号通路等活动在肝再生启动和进展阶段减弱。本研究证实Rat Genome 230 2.0表达谱芯片的检测结果是可靠的;再生肝星形细胞的增殖主要在PH后36h开始,主要通过跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路和细胞因子介导的信号通路的调控完成;胰岛素样生长因子及其结合蛋白含量的增加,对星形细胞的生长有明显的促进作用;星形细胞会在生长激素的刺激下马上展现分化的特征,但是随着肝再生的进程,Notch信号通路会抑制星形细胞的分化。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-14
第一部分文献综述  14-46
  1 肝再生研究进展  14-29
    1.1 肝脏的结构和功能  14
    1.2 肝再生  14-16
    1.3 肝再生模型  16-17
    1.4 肝再生的调控  17-29
  2 肝星形细胞与肝再生  29-33
    2.1 肝星形细胞的结构  29
    2.2 肝星形细胞的功能  29-30
    2.3 肝星形细胞的标志物  30
    2.4 肝星形细胞与肝再生的相关性  30-32
    2.5 肝星形细胞的分离、纯化  32-33
  3 本论文研究目的及意义  33-34
    3.1 研究的目的和目标  33
    3.2 理论意义和应用前景  33-34
  参考文献  34-46
第二部分大鼠肝再生中星形细胞在基因组范围内的转录谱分析  46-159
  引言  47-48
  第一章材料与方法  48-67
    1 实验动物  48
    2 大鼠2/3 肝切除模型构建  48-49
    3 再生肝星形细胞的制备  49-51
      3.1 工作液配制  49-50
      3.2 再生肝星形细胞的分离、纯化  50-51
    4 再生肝组织的免疫组织化学  51-53
      4.1 工作液配制  51-52
      4.2 防脱载玻片制作  52
      4.3 取材固定  52
      4.4 石蜡切片制作  52
      4.5 石蜡切片染色  52-53
    5 再生肝星形细胞的免疫组织化学  53
      5.1 细胞涂片制作  53
      5.2 染色  53
    6 免疫印记  53-56
      6.1 工作液配制  53-54
      6.2 蛋白样品制备和浓度测定  54-55
      6.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳  55
      6.4 蛋白免疫印迹  55-56
      6.5 阳性条带分析  56
    7 总RNA 提取与纯化  56-57
      7.1 总RNA 提取  56
      7.2 总RNA 的质量检测  56-57
      7.3 总RNA 纯化  57
      7.4 纯化总RNA 的定量和质检  57
    8 荧光定量PCR  57-60
      8.1 引物的设计与合成  57-58
      8.2 标准曲线的制备  58-59
      8.3 定量PCR 检测  59-60
      8.4 定量分析  60
    9 Rat Genome 230 2.0 芯片检测  60-64
      9.1 总RNA 提取与纯化  60
      9.2 cDNA 的合成和纯化  60-61
      9.3 cRNA 的合成和纯化  61-62
      9.4 cRNA 片段化  62
      9.5 芯片杂交、洗脱和扫描  62-63
      9.6 芯片检测数据分析  63-64
    10 大鼠再生肝的星形细胞肝再生相关基因的确认  64
    11 大鼠再生肝的星形细胞肝再生相关基因的功能注释  64
    12 大鼠再生肝的星形细胞肝再生相关基因表达模式分析  64-65
    13 大鼠再生肝的星形细胞肝再生相关基因聚类分析  65
    14 大鼠再生肝星形细胞中新基因的功能预测  65-66
      14.1 预测新基因的cDNA 和氨基酸序列  65
      14.2 建立大鼠蛋白亚细胞定位方法  65
      14.3 预测新基因编码产物的亚细胞定位  65-66
    15 大鼠再生肝星形细胞肝再生相关基因编码的蛋白互作分析  66
    16 大鼠再生肝和星形细胞中基因协同作用和各种生理活动的相关性分析  66-67
  第二章研究结果  67-138
    1 再生肝细胞分散率、收率及分离的星形细胞纯度、活性  67-68
    2 再生肝的组织结构和星形细胞结构  68-71
    3 荧光定量PCR 检测结果与Rat Genome 230 2.0 芯片检测结果比较  71-72
    4 蛋白免疫印迹检测结果及其与Rat Genome 230 2.0 芯片检测结果比较  72-73
    5 大鼠肝再生中星形细胞的基因表达谱  73-75
    6 大鼠再生肝星形细胞中肝再生相关新基因的功能预测  75-76
    7 大鼠肝再生中星形细胞已知基因涉及的生理活动  76-135
      7.1 大鼠再生肝星形细胞中信号传导相关基因的表达变化  77-84
      7.2 大鼠再生肝星形细胞中损伤相关基因的表达变化  84-86
      7.3 大鼠再生肝星形细胞中应激反应相关基因的表达变化  86-88
      7.4 大鼠再生肝星形细胞中免疫反应相关基因的表达变化  88-91
      7.5 大鼠再生肝星形细胞中炎症反应相关基因的表达变化  91-93
      7.6 大鼠再生肝星形细胞中细胞活化相关基因的表达变化  93-94
      7.7 大鼠再生肝星形细胞中细胞建成相关基因的表达变化  94-96
      7.8 大鼠再生肝星形细胞中细胞增殖相关基因的表达变化  96-99
      7.9 大鼠再生肝星形细胞中细胞生长相关基因的表达变化  99-101
      7.10 大鼠再生肝星形细胞中细胞分化相关基因的表达变化  101-103
      7.11 大鼠再生肝星形细胞中细胞凋亡相关基因的表达变化  103-106
      7.12 大鼠再生肝星形细胞中细胞粘附相关基因的表达变化  106-108
      7.13 大鼠再生肝星形细胞中细胞迁移相关基因的表达变化  108-109
      7.14 大鼠再生肝星形细胞中DNA 修复相关基因的表达变化  109-111
      7.15 大鼠再生肝星形细胞中氨基酸及其衍生物代谢相关基因的表达变化  111-113
      7.16 大鼠再生肝星形细胞中核酸代谢相关基因的表达变化  113-115
      7.17 大鼠再生肝星形细胞中糖类代谢相关基因的表达变化  115-117
      7.18 大鼠再生肝星形细胞中脂类代谢相关基因的表达变化  117-119
      7.19 大鼠再生肝星形细胞中蛋白质代谢相关基因的表达变化  119-123
      7.20 大鼠再生肝星形细胞中有机酸代谢相关基因的表达变化  123-124
      7.21 大鼠再生肝星形细胞中辅因子代谢相关基因的表达变化  124-125
      7.22 大鼠再生肝星形细胞中胶原代谢相关基因的表达变化  125-127
      7.23 大鼠再生肝星形细胞中细胞因子合成相关基因的表达变化  127-129
      7.24 大鼠再生肝星形细胞中运输相关基因的表达变化  129-135
    8 肝星形细胞与再生肝组织的转录谱及生理活动差异  135-138
  第三章讨论  138-148
    1 肝星形细胞中的物质运输与大鼠肝再生  140-142
    2 肝星形细胞中的细胞建成与大鼠肝再生  142
    3 肝星形细胞中的细胞增殖与大鼠肝再生  142-143
    4 肝星形细胞中的细胞生长与大鼠肝再生  143
    5 肝星形细胞中的细胞分化与大鼠肝再生  143-144
    6 肝星形细胞中的细胞凋亡与大鼠肝再生  144
    7 肝星形细胞中的氨基酸及其衍生物代谢与大鼠肝再生  144-145
    8 肝星形细胞中的核酸代谢与大鼠肝再生  145
    9 肝星形细胞中的糖类代谢与大鼠肝再生  145-146
    10 肝星形细胞中的蛋白质代谢与大鼠肝再生  146
    11 肝星形细胞中的辅因子代谢与大鼠肝再生  146-147
    12 肝星形细胞中的胶原代谢与大鼠肝再生  147
    13 肝星形细胞中的细胞因子合成与大鼠肝再生  147-148
  参考文献  148-159
第三部分小结  159-160
附录 1 英文缩略语  160-163
附录 2 主要实验仪器  163-164
个人简介  164-165
在攻读博士学位期间参加的科研项目和发表的论文  165-166
致谢  166

大鼠再生肝中星形细胞的基因表达谱分析

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