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建立果蝇模型研究人类泛酸激酶依赖型神经退行性疾病

作　者: 吴志浩
导　师: 周兵
学　校: 清华大学
专　业: 生物学
关键词: 果蝇人类神经退行性疾病泛酸激酶 PKAN
分类号: R741
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

人类泛酸激酶依赖型神经退行性疾病(Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration,PKAN)是一种严重的常染色体隐性遗传性疾病。其典型症状为运动机能障碍、寿命缩短、基底核核团铁积累和神经细胞退行性病变。PKAN的致病基因是人泛酸激酶2(PANK2)基因,目前其发病机制尚不明确:一、PKAN的发病是否因为PanK2泛酸激酶活性的丧失还不确定。另外,PanK2是人PanK家族成员中唯一定位在线粒体的蛋白,对其特性缺乏体内研究支持,还不清楚它与细胞质定位的其他PanK有何不同,也不清楚这种特殊性是否与PKAN的发病相关。由于PanK2敲除的小鼠模型无法很好地模拟PKAN的疾病表征,也无法针对上述问题开展研究;为此,我们需要建立一个新的动物模型。果蝇中只有一个PANK同源基因fbl, fbl突变果蝇会表现出明显的异常。本研究中,我们以fbl果蝇为基础,在其遗传背景下表达了人PanK2的致病突变,建立了PKAN的果蝇模型。该果蝇模型忠实地模仿了PKAN病人的症状和病理学变化。利用此模型,我们发现果蝇Fbl是人PanK2的直系同源蛋白,它们的亚细胞定位与生理活性十分相似;证明了PKAN的严重程度与体内泛酸激酶总活性直接相关,而并非由其它特殊功能引起;还发现中枢神经系统功能和精子发育对体内泛酸激酶活性变化最敏感,这种敏感缺陷不能被胞质PanK(PanK3和4)挽救;最后,我们演示了如何利用果蝇模型进行PKAN的治疗性药物初筛,寻找有效的化合物。我们的研究结果暗示,PanK2在线粒体外没有活性;相反,其它胞质PanK却是在胞质中有活性而在线粒体中没有。这种区别说明定位在线粒体和胞质PanK的调节机制差异很大。同时,PanK2可能是比其他胞质PanK体内活性更强的泛酸激酶。简而言之,本研究中我们建立起一个可以用来研究PKAN发病机制的新的动物模型,并进一步探索了PKAN的病发机制和治疗方法。希望此工作能够加深我们对于PKAN的理解,并对后人的研究有所裨益。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-11
主要符号对照表  11-12
第1章研究背景  12-35
  1.1 人类神经退行性疾病  12-18
    1.1.1 常见的人类神经退行性疾病  13-14
    1.1.2 罕发性的神经退行性疾病  14-16
    1.1.3 人类神经退行性疾病的模型和研究方法  16-18
  1.2 人类泛酸激酶依赖型神经退行性疾病（PKAN）  18-29
    1.2.1 PKAN 的临床症状  18-21
    1.2.2 PKAN 的致病基因  21
    1.2.3 PanK 蛋白的生物学功能  21-23
    1.2.4 PKAN 的单细胞生物模型  23-24
    1.2.5 PKAN 的动物模型  24-26
    1.2.6 PKAN 的发病机理和假说  26-29
  1.3 利用果蝇研究神经退行性病变  29-32
    1.3.1 人类和果蝇的相似性  29-30
    1.3.2 利用果蝇研究神经退行性疾病的方法  30-31
    1.3.3 利用果蝇研究神经退行性疾病的优势  31-32
  1.4 本论文的研究目的和意义  32-33
  1.5 论文各部分的主要内容  33-35
第2章 Fbl 蛋白的性质分析与功能验证  35-56
  2.1 实验材料与方法  35-44
    2.1.1 序列同源性分析  35
    2.1.2 fbl 基因结构预测分析  35
    2.1.3 Fbl 剪切异构体亚细胞定位预测  35-36
    2.1.4 果蝇S2 细胞转染载体构建  36-37
    2.1.5 果蝇S2 细胞系培养和瞬时转染  37
    2.1.6 激光共聚焦显微镜荧光成像分析  37-38
    2.1.7 果蝇UAS/GAL 表达系统  38-39
    2.1.8 果蝇表达载体构建  39-40
    2.1.9 果蝇品系培养、杂交和转基因操作  40-43
    2.1.10 果蝇羽化率和寿命测定  43-44
    2.1.11 果蝇行为学测试  44
    2.1.12 统计学分析  44
  2.2 实验结果  44-53
    2.2.1 Fbl 是果蝇中PanK2 的直系同源蛋白（ortholog）  44-45
    2.2.2 果蝇基因组中fbl 基因的结构  45-46
    2.2.3 Fbl 剪切异构体的亚细胞定位预测  46-47
    2.2.4 Fbl 剪切异构体的亚细胞定位研究  47-48
    2.2.5 Fbl 剪切异构体的功能分析——羽化和寿命  48-51
    2.2.6 Fbl 剪切异构体的功能分析——运动和育性  51-53
    2.2.7 人PanK2 蛋白可以互补fbl 基因突变表型  53
  2.3 实验结果讨论  53-56
第3章 PKAN 的果蝇模型  56-73
  3.1 实验材料和方法  56-59
    3.1.1 果蝇表达载体构建  56-57
    3.1.2 果蝇品系培养、杂交和转基因操作  57
    3.1.3 果蝇羽化率和寿命测定  57
    3.1.4 果蝇行为学测试  57
    3.1.5 果蝇成虫神经系统切片及染色  57-59
    3.1.6 果蝇雄蝇精巢解剖及染色  59
    3.1.7 统计学分析  59
  3.2 实验结果  59-70
    3.2.1 建立含PanK2 致病突变的转基因果蝇品系  59-61
    3.2.2 PanK2 突变对果蝇的影响——羽化和寿命  61-62
    3.2.3 PanK2 突变对果蝇的影响——运动和育性  62-64
    3.2.4 PanK2 突变模拟PKAN 神经退行性病变  64-67
    3.2.5 PanK2 突变引起雄蝇精子发育异常  67-70
  3.3 实验结果讨论  70-73
第4章 PKAN 发病的分子生物学机制  73-92
  4.1 实验材料与方法  73-79
    4.1.1 果蝇表达载体构建  73-74
    4.1.2 果蝇品系培养、杂交和转基因操作  74
    4.1.3 果蝇成虫总RNA 提取、反转录和RT-PCR 鉴定  74-76
    4.1.4 果蝇总蛋白提取和免疫印迹实验（western blot）  76-77
    4.1.5 果蝇羽化率和寿命测定  77
    4.1.6 果蝇行为学测试  77
    4.1.7 果蝇泛酸激酶活性测定  77-78
    4.1.8 统计学分析  78-79
  4.2 实验结果  79-88
    4.2.1 FblL 转基因果蝇品系表达水平检测  79-80
    4.2.2 FblL 表达量降低会导致PKAN 类似表型  80-83
    4.2.3 PanK2 突变蛋白的泛酸激酶活性检测  83-84
    4.2.4 PanK3, 4 互补fbl 基因突变——羽化率和寿命  84-86
    4.2.5 PanK3, 4 互补fbl 基因突变——运动和育性  86-88
  4.3 实验结果讨论  88-92
第5章利用果蝇模型分析PKAN 的病发特征  92-108
  5.1 实验材料与方法  92-95
    5.1.1 果蝇RNAi 技术  92
    5.1.2 果蝇品系、培养条件和杂交设计  92-93
    5.1.3 果蝇成虫总RNA 提取、反转录和RT-PCR 鉴定  93
    5.1.4 果蝇羽化率和寿命测定  93-94
    5.1.5 果蝇行为学测试  94
    5.1.6 果蝇GAL4 品系相对表达量比较  94
    5.1.7 利用fbl 突变果蝇进行药物初筛  94-95
    5.1.8 统计学分析  95
  5.2 实验结果  95-105
    5.2.1 利用果蝇RNAi 研究PKAN 的组织易感性  95-99
    5.2.2 PKAN 的中枢神经系统易感性分析——羽化和寿命  99-101
    5.2.3 PKAN 的中枢神经系统易感性分析——运动能力  101-103
    5.2.4 利用f611突变果蝇进行化合物筛选  103-105
  5.3 实验结果讨论  105-108
第6章结论  108-110
参考文献  110-117
致谢  117-118
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  118

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