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拟南芥AtFes1A与植物耐热性

作　者: 张景霞
导　师: 刘箭
学　校: 山东师范大学
专　业: 植物学
关键词: 热敏感突变体核苷酸转换因子分子伴侣信号转导泛素化
分类号: Q945
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

热激蛋白HSP70通过ATPase循环完成其功能。多种蛋白及辅助分子伴侣参与HSP70的ATPase循环,如J蛋白和底物能够刺激HSP70水解ATP生成ADP,而ADP脱离HSP70则需要核苷酸交换因子(Nucleotide Exchange Factors,NEFs)的协助,因此, NEFs是HSP70分子伴侣体系中的一类关键辅助因子。目前,NEFs的研究多集中于原核生物(大肠杆菌中的GrpE)、酵母(Fes1p、Sse1p)和哺乳动物(Bag-1、HspBP1)中,有关植物NEFs的研究尚未见报道。为此,作者对酵母Fes1基因在拟南芥中的同源物进行了研究。拟南芥基因组中存在三个Fes1基因的同源物,它们都归属于ARM(Armadillo repeat)蛋白家族。作者将它们命名为AtFes1A(At3g09350)、AtFes1B (At3g53800)、AtFes1C (At5g02150)。Real-Time PCR实验证实,在这三个成员中,AtFes1A是高温诱导下表达量最高的一个,所以作者主要研究了AtFes1A基因。对AtFes1A的定位和表达特性进行研究,发现AtFes1A是一个定位在细胞质中的,受高温诱导表达的蛋白。作者自ABRC订购了AtFes1A基因的T-DNA插入突变体(salk-021784和salk-012416),对AtFes1A基因的功能进行研究。最后,作者以热敏感的北美萤火虫萤光酶作为靶标蛋白,研究了AtFes1A基因缺失导致拟南芥热敏感的原初起因。主要实验结果如下:1.拟南芥基因组中存在三个Fes1的同源基因:AtFes1A、AtFes1B和AtFes1C。AtFes1A是三个成员中高温诱导表达最高的一个基因。在Fes1基因缺失酵母中导入高拷贝质粒pYX242携带的AtFes1A基因的cDNA序列,发现酵母的热敏感表型基本得到恢复,说明在耐热方面,AtFes1A具有与酵母Fes1相似的功能。为确定AtFes1A基因的表达特性,作者检测了该基因在高温、低温、干旱、NaCl胁迫下的表达水平。实验结果表明,AtFes1A基因的表达受高温诱导强烈表达,在低温和干旱胁迫下表达稍有上调,NaCl不能诱导AtFes1A基因的表达。利用农杆菌侵染的方法,将含有AtFes1A基因的cDNA序列和GFP基因的融合基因转化拟南芥,GFP荧光分析发现:GFP在保卫细胞和原生质体的细胞质中表达,说明AtFes1A基因定位在细胞质中。为检测AtFes1A蛋白能否加速ADP脱离从而提高HSP70蛋白的ATPase活性,作者利用孔雀绿-钼酸铵分光光度法进行了稳态的ATPase实验,通过检测HSP70水解ATP产生无机磷的速度来判断AtFes1A是否对HSP70具有刺激作用。实验结果表明,高浓度或低浓度的AtFes1A对HSP70的ATPase活性都没有明显的影响,说明AtFes1A可能不具有刺激ADP加速脱离HSP70的功能。2.自ABRC订购了AtFes1A基因的T-DNA插入突变体(salk-021784和salk-012416)。通过PCR及测序对T-DNA插入AtFes1A基因的位置进行鉴定。salk-021784和salk-012416突变体中T-DNA分别插入AtFes1A基因的第六外显子和第五内含子上,突变体的纯合子中检测不到AtFes1A基因的转录产物和蛋白。获得耐热性实验表明,与野生型相比,突变体在下胚轴延伸时期和幼苗时期都有明显的获得耐热性缺陷,突变体种子萌发时期的耐热性也明显降低。突变体salk-021784的互补实验表明,AtFes1A基因的表达能够基本修复突变体的热敏感表型。以上结果充分说明,突变体的热敏感表型确实是由于AtFes1A基因敲除引起的。3.为研究AtFes1A基因突变导致拟南芥热敏感的原因,作者检测高温处理后,与耐热相关的HSPs(HSP70、HSP101、sHSP classI和sHSP classII)基因和Hsfs(HsfA2和HsfB1)基因转录本的表达情况。Northern杂交结果显示,与野生型相比,突变体salk-021784中HSPs和Hsfs基因的转录本水平较高。为验证实验结果的可靠性,作者利用Real-Time PCR对突变体(salk-021784和salk-012416)中耐热相关的HSPs和Hsfs基因的转录本进行了检测,所得结果Northern杂交的结果一致。以上结果充分说明,AtFes1A基因缺失导致耐热相关的热激蛋白基因的转录本升高。因此,AtFes1A是热激蛋白信号转导的负调控因子。HSP70的高表达能够抑制其他热激蛋白的表达。在salk-021784中,HSP70以及其他的一些热激基因的转录本都上调,HSP70的高表达并没有起到抑制作用。因此,作者检测了salk-021784突变体中HSP70蛋白水平的表达。结果发现,与野生型相比,突变体中的HSP70的蛋白含量并没有因为其转录本的升高而升高,而是明显低于野生型中的。本研究首次报导了AtFes1A能够影响HSP70的稳定性。4.作者利用western-blotting杂交检测了热激后,salk-021784和野生型拟南芥中全蛋白的泛素化程度。Western-blotting杂交结果表明,与野生型相比,salk-021784突变体中有更多的变性蛋白底物被标记了泛素分子,突变体中有更多的变性蛋白被蛋白酶降解。为更进一步的研究拟南芥热敏感的原因,作者构建了番茄线粒体小分子热激蛋白LeHSP23.8启动子驱动的萤光酶基因的植物表达载体,利用农杆菌侵染法转化salk-021784和野生型拟南芥。转萤光酶基因拟南芥在38℃适应2h以激活萤光酶的表达(热激启动子驱动),随后45℃高温处理2h灭活萤光酶,放置在培养箱中恢复,检测恢复不同时间的萤光酶的活力。实验结果发现,与野生型中的萤光酶相比,突变体中的萤光酶的复性程度明显较低。此外,作者还利用western-blotting检测了恢复不同时间的可溶性的萤光酶的水平。实验结果显示,在突变体中的可溶性萤光酶的含量较低,此实验结果暗示萤光酶的活性较低是由于萤光酶可溶性蛋白含量少造成的。利用麦胚系统(用抗AtFes1A抗体封闭麦胚中的AtFes1A蛋白或在麦胚中添加AtFes1A蛋白)检测变性萤光酶的复性情况。实验结果显示,AtFes1A的存在对萤光酶的复性没有显著的影响,说明,在体外的实验中,AtFes1A不能影响分子伴侣机器的功能。总之, AtFes1A是新发现的,影响细胞质HSP70稳定性和影响变性底物复性的,植物耐热相关基因。本文主要创新点:在国际上首次报道了拟南芥AtFes1A基因是植物耐热性相关基因,对拟南芥AtFes1A的亚细胞定位,AtFes1A对细胞质HSP70稳定性的调控,AtFes1A对热激蛋白信号转导的调控,以及AtFes1A对变性底物复性的影响首次进行了研究。

全文目录

中文摘要  8-11
英文摘要  11-15
英文缩略词表  15-17
第一部分文献综述  17-40
  一 HSP70 及其辅助分子伴侣  17-29
    1 HSP70  17-20
      1.1 HSP70 的结构  17-19
      1.2 HSP70 的种类  19
      1.3 HSP70 的ATPase 循环  19-20
    2 J 蛋白  20-22
      2.1 J 蛋白的结构和种类  20-21
      2.2 J 蛋白的作用机制  21-22
    3 核苷酸转换因子  22-29
      3.1 GrpE  23
      3.2 BAG 蛋白  23-24
      3.3 HspBP1  24-26
      3.4 HSP110  26
      3.5 植物中的NEF 研究现状  26-29
  二拟南芥热敏感突变体的研究进展  29-40
    1 拟南芥的诱变方法  29-34
      1.1 物理诱变  30
      1.2 化学诱变  30-31
      1.3 插入突变  31-34
    2 拟南芥热敏感突变体的筛选方法  34-36
      2.1 基础耐热性缺失的突变体的筛选  34-35
      2.2 获得耐热性缺失的突变体的筛选  35-36
    3 拟南芥热敏感突变体研究现状  36-40
      3.1 热激蛋白类  36-37
      3.2 热激转录因子类  37
      3.3 Ca~(2+)/CaM 相关的热敏感突变体  37
      3.4 植物激素信号途径相关类  37-38
      3.5 泛素化相关的热敏感突变体  38
      3.6 其他因子  38-40
第二部分实验论文  40-121
  第一章 atfes1a 基因基本的生物学特性分析  40-73
    1 实验材料  40-42
    2 实验方法  42-56
      2.1 酵母功能互补实验  42-44
      2.2 质粒的提取与转化  44-47
      2.3 Western 杂交  47-48
      2.4 实时定量PCR  48-50
      2.5 atfes1a 蛋白的亚细胞定位  50-52
      2.6 稳态的ATPase 实验  52-56
    3 结果与分析  56-71
      3.1 atfes1a 基因的系统进化分析结果  56-57
      3.2 atfes1a 基因与酵母Fe51 基因功能互补  57-60
      3.3 atfes1a 基因在逆境条件下的表达特性  60-63
      3.4 atfes1a 蛋白定位于细胞质  63-66
      3.5 atfes1a 不影响稳态的ATPase 体外活性  66-71
    4 讨论  71-73
  第二章拟南芥atfes1a 突变体及其互补系的耐热性分析  73-88
    1 实验材料  73
    2 实验方法  73-76
      2.1 拟南芥atfes1a突变体salk-021784、salk-012416的筛选和分子鉴定  73-75
      2.2 atfes1a 突变体的耐热性分析  75
      2.3 salk-021784 热敏感突变体的互补实验  75-76
    3 结果与分析  76-87
      3.1 atfes1a 突变体salk-021784、salk-012416 的分子鉴定结果  76-79
      3.2 atfes1a 缺失导致拟南芥耐热性下降  79-83
      3.3 过表atfes1a 可以修复salk-021784 突变体的热敏感缺陷  83-87
    4 讨论  87-88
  第三章 atfes1a 对热激蛋白信号转导的影响  88-106
    1 实验材料  88
    2 实验方法  88-93
      2.1 atfes1a 突变体中热激蛋白转录本的Northern 杂交分析  88-91
      2.2 atfes1a 突变体中热激蛋白转录本的实时定量PCR 分析  91-92
      2.3 高温对atfes1a 突变体中HSP70 蛋白水平的影响  92-93
    3 结果与分析  93-102
      3.1 atfes1a 基因缺失上调热激基因的转录本水平  93-98
      3.2 atfes1a 基因缺失导致HSP70 蛋白水平下降  98-102
    4 讨论  102-106
  第四章 atfes1a 突变体热敏感成因初探  106-121
    1 实验材料  106
    2 实验方法  106-110
      2.1 Western 检测全蛋白的泛素化程度  106
      2.2 转萤光酶基因拟南芥的萤光酶复性实验  106-108
      2.3 体外的分子伴侣系统功能的检测  108-110
    3 结果与分析  110-118
      3.1 atfes1a 基因缺失导致高温下全蛋白泛素化加强  110-111
      3.2 atfes1a 基因缺失导致高温胁迫后萤光酶复性变慢  111-115
      3.3 atfes1a 不介入分子伴侣系统活性  115-118
    4 讨论  118-121
总结  121-123
参考文献  123-136
攻读博士学位期间整理发表的论文  136-137
致谢  137

拟南芥AtFes1A与植物耐热性

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