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二化螟对三唑磷的靶标抗性研究

作　者: 姜晓静
导　师: 韩召军
学　校: 南京农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 二化螟 三唑磷 靶标抗性 乙酰胆碱酯酶 基因突变 分子检测 真核表达 实时定量PCR
分类号: S435.112.1
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


二化螟Chilo suppressalis是水稻的重要害虫之一,由于它钻蛀危害水稻茎秆,因而给化学防治带来一定的难度。采用的杀虫剂通常是渗透性强、具有一定的内吸作用、可传导,而且环境相容性好,价格合理农民可以承受的药剂品种。三唑磷最初以其优异的防治效果以及合理的价格成为继六六六、杀虫脒、杀虫单之后防治二化螟的主要替代药剂。但最近频频出现三唑磷对二化螟防治效果下降的报道,而且本实验室的前期工作也证实田间二化螟对三唑磷产生了显著的抗药性,并分析了抗药性的生化机理,发现三唑磷抗性二化螟除解毒酶活力加强外,其乙酰胆碱酯酶的敏感性也显著降低。在此基础上,本研究阐明了二化螟对三唑磷靶标抗性的分子机理,确定了靶标的抗性突变位点,进而建立了抗药性分子监测技术,为抗性二化螟治理和新药剂开发提供了新技术和新思路。1.二化螟乙酰胆碱酯酶基因的克隆和序列分析利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获取了二化螟AChE1基因全长,共2521 bp,其中5’-UTR为235 bp,3’-UTR为204 bp。由cDNA序列推导出来的氨基酸序列包括17个氨基酸的信号肽和677个氨基酸的成熟蛋白,与二化螟AChE2的相似性仅为47%,但与GenBank中其它鳞翅目昆虫的AChE1氨基酸序列的相似性较高,在75%～90%之间；而二化螟AChE2氨基酸序列与小菜蛾、苹果蠹蛾、棉铃虫、烟夜蛾以及家蚕的AChE2序列也具有很高的相似性,均大于90%以上。所推导的二化螟AChE1氨基酸序列具有AChE基因的特征性氨基酸残基,其中包括：(1)形成催化三联体的三个氨基酸残基Ser313、Glu439. His553;(2)活性部位的Ser313存在于所有胆碱酯酶中均存在的FGESAG序列中；(3)形成亚基内二硫键的6个保守氨基酸Cys181-Cys208,Cys 367-Cys 380,Cys515-Cys637,以及亚基间的保守氨基酸Cys660；(4)胆碱结合亚部位W198；(5)酰基口袋W346、F402、F443；(6)氧负离子孔G232、G233、A314。因此推断所获得的cDNA序列为二化螟AChEl的cDNA序列。2.二化螟抗三唑磷品系乙酰胆碱酯酶的点突变分析在室内用三唑磷对2003年采自浙江省苍南县的二化螟进行连续6代筛选,与2006年6月采自江苏连云港的赣榆地区的二化螟敏感品系比较,抗性水平达到1172倍。对敏感和抗性个体的AChE1、AChE2全长序列分别进行克隆和对比分析,结果发现所有三唑磷抗性二化螟个体的AChE1,在对应于电鳐Torpedocalifornica的AChE氧负离子孔A201这一功能位点上,发生了固定的点突变(A314S)。Ala与Ser的侧链分别是-CH3和-CH2OH,因此我们推测可能是该侧链的变化改变了相邻的催化三亚基中Ser的构象,最终影响了AChE1与抑制剂间的相互作用。另外,在抗性棉蚜和小菜蛾体内也发现了同样的点突变。由此分析认为AChE1的A314S突变很可能是导致二化螟靶标敏感性下降的功能突变位点。3.不同二化螟地理种群对三唑磷靶标抗性的分子检测通过抗性和敏感品系的二化螟AChE1的核酸序列比较发现,抗性相关突变A314S中从鸟嘌呤到胸腺嘧啶的碱基颠换(G／T),导致突变型基因组上的MspA1Ⅰ酶切位点发生变化。根据这个特点,本研究设计了基于RFLP-PCR的分子检测技术进行突变型等位基因的快速检测。结果显示,敏感纯合子SS基因组DNA的PCR产物被MspA1Ⅰ酶切为534bp和224bp两个片段；杂合子RS基因组DNA的PCR产物被MspA1Ⅰ酶切处理后,电泳检测到758bp、534bp和224bp三个片段；而抗性纯合子RR基因组DNA的PCR产物不能被MspA1Ⅰ酶切,电泳检测只有758bp一个片段。2007年、2008年利用该技术分别检测了7个不同田间地理种群的抗性水平,结果发现检测的抗性等位基因频率与已报道的有机磷杀虫剂抗性相符。该结果不仅创建了灵敏准确的二化螟靶标抗性分子检测技术,同时反证了该突变位点就是抗性功能突变位点。4.二化螟两个乙酰胆碱酯酶基因的相对表达量及体外真核表达利用实时定量PCR技术比较了野生型AChE1和AChE2两个基因在二化螟中的mRNA表达水平,发现在四龄幼虫中AChE1基因的表达量是AChE2的4.8倍。进一步构建了野生型AChE1和AChE2基因的供体质粒pFastBacl-AChE1和pFastBacl-AChE2;利用定点突变技术将突变A314S引入pFastBacl-AChE1构建成pFastBacl-AChE1Mu;将构建好的质粒pFastBacl-AChE1、pFastBacl-AChE2以及pFastBacl-AChE1Mu转到DH10BAC中,利用昆虫杆状病毒表达体系用重组病毒感染Tn细胞进行体外酶蛋白表达,收集细胞进行SDS-PAGE检测和蛋白杂交实验以及酶活测定。结果发现,虽然SDS-PAGE结果和蛋白杂交实验均证实目标蛋白在Tn细胞中正确表达,但酶活测定结果显示,体外表达的二化螟AChE1、AChElMu没有活性,AChE2的活性仅为1.954OD／min／mg。其原因可能是目前采用的系统不适宜表达二化螟AChE,二化螟2个AChE的生理毒理学特性尚有待利用其他表达体系进行进一步研究。综上所述,本研究的创新点包括以下三点：1.确定了二化螟有两个乙酰胆碱酯酶基因,为以后的AChEs的功能研究以及毒理学研究奠定了基础。2.发现了二化螟对三唑磷的靶标抗性突变位点,从分子水平上解释二化螟抗性表型产生的分子机理。3.建立了二化螟对三唑磷靶标抗性分子检测技术,为抗性二化螟治理和新药剂开发提供了新技术和新思路。

全文目录


摘要  7-10
ABSTRACT  10-13
第一章 文献综述  13-43
  1 二化螟抗性研究概况  13-19
    1.1 二化螟分布及为害  13-16
    1.2 二化螟化学防治与抗药性  16-19
  2 昆虫对杀虫剂的代谢抗性研究进展  19-23
    2.1 酯酶抗性研究进展  19-21
      2.1.1 酯酶基因的过表达  19-20
      2.1.2 酯酶基因突变  20-21
    2.2 多功能氧化酶系抗性研究进展  21-23
    2.3 谷胱甘肽S-转移酶抗性研究进展  23
  3 昆虫对杀虫剂的靶标抗性研究进展  23-42
    3.1 γ-氨基丁酸受体  24-25
    3.2 钠离子通道  25-28
    3.3 烟碱型乙酰胆碱受体  28-29
    3.4 乙酰胆碱酯酶  29-42
      3.4.1 乙酰胆碱酯酶的高级结构  29-31
      3.4.2 AChE高级结构中影响底物结合的相关位点  31-34
      3.4.3 AChE的酶动力学参数  34-35
      3.4.4 乙酰胆碱酯酶与昆虫抗药性  35-41
      3.4.5 昆虫体内的乙酰胆碱酯酶  41-42
  4 二化螟对三唑磷靶标抗性机理研究的目的和意义  42-43
第二章 二化螟乙酰胆碱酯酶基因的克隆  43-51
  1 材料和方法  44-47
    1.1 供试二化螟及饲养  44
    1.2 主要试剂和仪器  44
    1.3 总RNA提取和RT-PCR  44-45
    1.4 引物  45
    1.5 PCR和RACE  45
    1.6 PCR产物纯化  45-46
    1.7 质粒载体的连接反应和转化  46
      1.7.1 连接反应  46
      1.7.2 转化反应和细菌培养  46
    1.8 质粒DNA测序及序列分析  46-47
  2 结果与分析  47-50
    2.1 二化螟乙酰胆碱酯酶基因的克隆  47
    2.2 二化螟乙酰胆碱酯酶的序列分析  47-49
    2.3 二化螟AChEs与其它鳞翅目昆虫的同源性  49-50
  3 讨论  50-51
第三章 二化螟抗三唑磷品系乙酰胆碱酯酶的点突变分析  51-59
  1 材料和方法  52-54
    1.1 供试二化螟  52
    1.2 供试药剂  52-53
    1.3 生物测定方法  53
    1.4 主要试剂和仪器  53
    1.5 总RNA提取和RT-PCR  53
    1.6 PCR扩增及产物克隆、测序与序列分析  53-54
  2 结果与分析  54-57
    2.1 抗性筛选及毒力测定  54
    2.2 二化螟抗感品系AChEs氨基酸比对  54-57
  3 讨论  57-59
第四章 不同二化螟地理种群对三唑磷靶标抗性的分子检测  59-67
  1 材料和方法  60-62
    1.1 供试二化螟  60
    1.2 主要试剂和仪器  60
    1.3 二化螟基因组DNA的提取  60-61
    1.4 二化螟基因组DNA片段克隆  61-62
    1.5 PCR产物的酶切反应及检测  62
  2 结果与分析  62-65
    2.1 RFLP-PCR检测点突变方法的确立  62-63
    2.2 RFLP-PCR对不同地理种群的检测  63-65
  3 讨论  65-67
第五章 二化螟两个乙酰胆碱酯酶基因的相对表达量以及体外真核表达分析  67-87
  1 材料和方法  68-78
    1.1 菌种与载体  68
    1.2 主要试剂及仪器  68-69
    1.3 二化螟两个乙酰胆碱酯酶基因的相对定量分析  69-70
      1.3.1 实时荧光定量PCR模板的准备  69
      1.3.2 引物设计  69-70
      1.3.3 实时荧光定量PCR反应  70
      1.3.4 AChE基因mRNA表达量的比较  70
    1.4 二化螟乙酰胆碱酯酶基因真核表达实验方法  70-78
      1.4.1 二化螟乙酰胆碱酯酶基因真核表达供体质粒构建  70-72
      1.4.2 定点突变  72-73
      1.4.3 昆虫细胞的培养  73
      1.4.4 重组病毒的构建  73-75
      1.4.5 重组病毒Bacmid DNA对昆虫细胞的的转染及感染  75-76
      1.4.6 表达产物的SDS-PAGE分析  76-77
      1.4.7 Western blotting  77
        1.4.7.1 蛋白质从凝胶转移至PVDF膜  77
        1.4.7.2 杂交与检测  77
      1.4.8 酶活测定  77-78
  2 结果与分析  78-84
    2.1 实时定量PCR产物熔解曲线分析  78-79
    2.2 二化螟AChE1和AChE2基因相对表达量分析  79
    2.3 供体质粒构建  79-80
    2.4 定点突变分析  80-81
    2.5 重组杆状病毒Bacmid的获得  81-82
    2.6 重组Bacmid感染Tn细胞  82
    2.7 SDS-PAGE检测  82-83
    2.8 Western blotting分析  83
    2.9 表达产物的生物活性分析  83-84
  3 讨论  84-87
全文总结  87-89
参考文献  89-105
附录:攻读学位期间发表的学术论文以及专利申请  105-107
致谢  107-108

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 虫害 > 水稻螟虫
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