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β-榄香烯脂质体的研究

作　者: 王秀敏
导　师: 邓英杰；赵春杰
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 药剂学
关键词: 热敏脂质体 长循环脂质体 β-榄香烯 药效学 组织分布和药物动力学
分类号: TQ461
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


β-榄香烯是从中药温莪术（Curcuma wenyujin Chen et C. Ling）的干燥根茎中提取分离得到的倍半萜烯类化合物。β-榄香烯是具有特异性细胞毒性的广谱抗癌药物，具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗病毒、提高机体免疫力、抑制血小板凝集、改善微循环等作用。其现有制剂，乳注射剂、口服乳等，在临床上主要用于治疗癌性胸腹水、肝癌、肺癌、脑瘤等，疗效确切。近几年来，β-榄香烯已经成为抗癌药物的一个研究热点，也是中药西制的一个典范。β-榄香烯不溶于水，口服生物利用度极低，腹腔注射生物利用度也仅有8.49％，静脉注射可迅速被机体消除。β-榄香烯制剂在临床应用中的一个严重的副作用是血管刺激性较大，静脉炎发生率达30％。基于以上原因，本论文的主要研究目的就是通过脂质体新剂型解决β-榄香烯血管刺激性、提高其生物利用度、延长其静脉注射给药时的体内半衰期，进而靶向肿瘤，提高抗肿瘤疗效。为此我们设计了三种不同类型的脂质体，即β-榄香烯普通脂质体（CLE）、长循环脂质体（PLE）和热敏长循环脂质体（TLLE）。本论文主要包括以下内容：1．β-榄香烯的分离和理化性质测定。温莪术挥发油中分离提取得到了β-榄香烯，并对其理化性质，如油水分配系数、折光率、旋光度、在不同溶剂中的溶解度进行了测定，同时考察了β-榄香烯在乙醇溶液中的稳定性。结果，β-榄香烯油水分配系数为199.5，折光率为1.4932，比旋度为-16.359°，在各种有机溶剂中溶解度均较大。在40℃、60℃加热的条件下，β-榄香烯含量均有所下降。2．CLE、PLE、TLLE的制备及制剂性质考察。乙醇注入法为CLE、PLE的制备方法，在单因素考察和正交试验基础上优化CLE处方。结果表明，脂药比、磷脂浓度、水相介质种类对CLE包封率影响较大，其他因素对包封率影响较小。最后确定CLE的最优处方，得到了包封率较高（92.3％）的CLE；通过考察DSPE-PEG2000的用量，在CLE最优处方的基础上，确定了PLE的处方（包封率95.2％）；以相变温度和包封率为指标，确定了薄膜分散法制备TLLE的处方，该处方相变温度为41.8℃，符合临床热疗的要求，包封率为87.9％；对CLE、PLE和TLLE的理化性质及制剂稳定性进行了考察。结果，CLE、PLE和TLLE为小单室脂质体，CLE、PLE较TLLE稳定，4℃、25℃下12个月内稳定性较好。3．CLE、PLE和TLLE的药物动力学和组织分布的研究。建立了快速、准确、简单的生物样品中p-榄香烯气相色谱分析方法。大鼠尾静脉注射50 mg／kg以上三种制剂后，与市售制剂EE相比，TLLE的t1/2、AUC（0→t）、MRT（0→t）分别为EE的3.2、4.2、2.3倍，统计学分析有显著性差异（P＜0.001）；PLE的t1/2、AUC（0→t）、MRT0→t)分别为EE的2.7、3.9、2.3倍（P＜0.001）；而与EE相比，CLE只使AUC（0→t）提高了1.5倍（P＞0.05），二者其他药动学参数间无显著性差异。药动学结果表明，PLE、TLLE均可使β-榄香烯体内循环时间延长，有长循环性；TLLE、PLE、CLE均可使β-榄香烯生物利用度得到显著提高。荷瘤小鼠尾静脉注射60mg／kg各种制剂，不同方案的组织分布结果表明，各治疗组肿瘤中药物分布由大到小的顺序为：TLLE+HT＞PLE+HT＞PLE＞CLE＞EE+HT＞EE。在热疗条件下，以EE+HT为对照，TLLE+HT有最大的肿瘤靶向性，靶向参数为2.57。在生理温度下，PLE、CLE较EE有更好的肿瘤靶向性（靶向参数分别为2.17、1.33）。TLLE、PLE在肝脾中药物分布量均降低，证明了TLLE、PLE可降低肝脾的摄取，更多地靶向肿瘤组织。尤其是TLLE有在加热部位快速释药的热敏性，使其对肿瘤组织的靶向性大大增加。另外，TLLE、PLE、CLE在脂肪中的分布均减少，有望可以克服EE在脂肪中的蓄积现象。4．CLE、PLE和TLLE药效学研究。在体外抗肿瘤试验中，以EE作为阳性对照药，用MTT试验测定了三种制剂对6种人癌细胞的半数抑制浓度。结果，细胞毒活性为PLE＞CLE≈TLLE＞EE，透射电镜对癌细胞结构的观察结果与MTT试验结果一致。体内药效学试验中，以荷瘤小鼠为动物模型，考察了不同给药方案荷瘤鼠的抑瘤率和生命延长率，结果显示，在40mg／kg剂量下，各组抑瘤效果由强至弱依次为：TLLE+HT（69％）＞PLE+HT（62％）＞CLE+HT（58％）=TLLE（58％）＞PLE（56％）＞EE+HT（51％）＞CLE（48％）＞EE（40％）＞HT（11％）。TLLE+HT组的抑瘤率高达69％。在生理体温（无热疗）条件下，各组比较时，PLE的抑瘤率较高，为56％。生命延长率实验中，生命延长百分率由大到小的顺序为PLE＞CLE＞TLLE。PLE、CLE可使荷瘤鼠存活时间延长约1倍；TLLE使荷瘤鼠存活时间延长约25.7％；EE无延长存活时间的作用。各组荷瘤鼠体重变化的结果表明，在抑瘤实验过程中荷瘤鼠的体重变化未超过正常范围，说明给药剂量比较适合，各种制剂毒副作用均较小。总之，CLE、PLE和TLLE体内外抗肿瘤效果均优于EE。5．CLE、PLE和TLLE的制剂安全性研究。CLE、PLE、TLLE均为静脉注射剂，本文对制剂的安全性从以下几个方面进行了评价。急性毒性实验考察小鼠最大耐受剂量；家兔溶血性试验考察制剂的渗透压是否合格，能否引起溶血；豚鼠的过敏试验考察制剂能否引起过敏反应；家兔的耳缘静脉刺激性试验考察制剂的血管刺激性。结果，三种制剂在制剂最大浓度和小鼠最大耐受剂量下均有良好的耐受性，无溶血现象、无过敏反应发生、对血管无刺激性，静脉给药是安全可行的。

全文目录


缩略语表  16-18
中文摘要  18-21
英文摘要  21-24
前言  24-38
第一章：β-榄香烯的分离  38-52
  1.实验仪器与材料  38
    1.1 仪器  38
    1.2 药品与试剂  38
  2.实验方法与结果  38-49
    2.1 柱层析法分离β-榄香烯  38-39
    2.2 β-榄香烯的薄层色谱分析  39-40
    2.3 β-榄香烯的气相色谱分析  40-41
    2.4 β-榄香烯的结构确认  41-49
      2.4.1 β-榄香烯的GC-MS分析  41-43
      2.4.2 紫外光谱  43
      2.4.3 红外光谱  43-45
      2.4.4 核磁共振光谱(NMR)  45-49
        2.4.4.1 β-榄香烯的~1H-NMR谱  45-47
        2.4.4.2 β-榄香烯的~(13)C-NMR谱  47-49
  3.讨论  49-50
  本章小结  50
  参考文献  50-52
第二章：β-榄香烯体外分析方法的建立及理化性质的研究  52-67
  第一节：β-榄香烯体外方法的建立  52-55
    1.仪器及材料  52
      1.1 仪器  52
      1.2 药品与试剂  52
    2.实验方法  52-53
      2.1 色谱条件的选择  52
      2.2 标准曲线的绘制  52-53
      2.3 分析方法的确证  53
        2.3.1 精密度试验  53
        2.3.2 回收率试验  53
    3.结果  53-55
      3.1 β-榄香烯的标准曲线  53-54
      3.2 日间和日内精密度  54
      3.3 回收率  54-55
    4.讨论  55
  第二节：β-榄香烯处方前基本理化性质的测定  55-59
    1.仪器与材料  55-56
      1.1 仪器  55
      1.2 药品与试剂  55-56
    2.实验方法  56
      2.1 β-榄香烯比旋度的测定  56
      2.2 β-榄香烯折光率的测定  56
      2.3 β-榄香烯在各种溶剂中溶解度的测定  56
    3.实验结果  56-58
      3.1 旋光度和比旋度的测定结果  56-57
      3.2 折光率的测定结果  57
      3.3 溶解度的测定结果  57-58
    4.讨论  58-59
  第三节：β-榄香烯油水分配系数的测定  59-63
    1.仪器与材料  59
      1.1 仪器  59
      1.2 药品与试剂  59
    2.实验方法  59-60
      2.1 色谱条件的选择  59
      2.2 标准曲线的绘制  59-60
      2.3 分析方法的确证  60
        2.3.1 精密度试验  60
        2.3.2 回收率试验  60
      2.4 油水分配系数的测定  60
    3.实验结果  60-62
      3.1 油水分配系数测定的标准曲线  60-61
      3.2 日间、日内精密度结果  61
      3.3 回收率结果  61-62
      3.4 油水分配系数的测定结果  62
    4.讨论  62-63
  第四节：β-榄香烯原料药稳定性考察  63-65
    1.仪器与材料  63
      1.1 仪器  63
      1.2 药品与试剂  63
    2.实验方法  63-64
      2.1 加速试验  63
      2.2 室温留样试验(长期试验)  63-64
    3.实验结果  64-65
      3.1 加速试验结果  64
      3.2 长期试验结果  64-65
    4.讨论  65
  本章小结  65
  参考文献  65-67
第三章：CLE、PLE、TLLE的制备和性质考察  67-91
  第一节 CLE、PLE的制备及包封率的测定  67-76
    1.仪器与材料  67
      1.1 仪器  67
      1.2 药品与试剂  67
    2.实验方法与结果  67-75
      2.1 CLE包封率测定方法的建立  67-70
        2.1.1 GC法测定CLE中总药量  67-69
          2.1.1.1 方法专属性考察  67-69
          2.1.1.2 乙醚萃取回收率的考察  69
        2.1.2 葡聚糖凝胶(SephadexG-50)微柱离心法对脂质体和游离药物的分离  69-70
          2.1.2.1 葡聚糖凝胶柱的制备  69
          2.1.2.2 葡聚糖凝胶柱对空白脂质体吸附作用考察  69
          2.1.2.3 葡聚糖凝胶柱对β-榄香烯吸附作用考察  69-70
      2.2 CLE的制备  70-74
        2.2.1 CLE制备方法的选择  70-71
        2.2.2 处方筛选  71-73
          2.2.2.1 磷脂量(浓度)对包封率的影响  71
          2.2.2.2 介质种类及离子强度对包封率的影响  71-72
          2.2.2.3 磷脂与胆固醇比例对包封率的影响  72-73
          2.2.2.4 脂药比对包封率的影响  73
          2.2.2.5 挤出比对包封率的影响  73
        2.2.3 正交试验优化CLE处方  73-74
      2.3 PLE处方的确定  74-75
    3.讨论  75-76
  第二节：β-榄香烯热敏长循环脂质体(TLLE)的制备  76-79
    1.仪器与药品  76
    2.方法  76-78
      2.1 TLLE制备方法的确定  76
      2.2 TLLE处方的筛选  76-77
      2.3 TLLE热敏性和长循环性的初步评价  77-78
    3.讨论  78-79
  第三节：CLE、PLE、TLLE理化性质及稳定性的研究  79-88
    1.仪器与药品  79
      1.1 仪器  79
      1.2 药品与试剂  79
    2.方法  79-87
      2.1 CLE、PLE、TLLE形态的观察  79-80
      2.2 CLE、PLE、TLLE粒径的测定  80-81
      2.3 CLE、PLE中乙醇残留量的测定  81-83
        2.3.1 色谱条件与系统适用性试验  81
          2.3.1.1 色谱条件  81
          2.3.1.2 溶液的配制  81
        2.3.2 系统适应性试验  81-83
          2.3.2.1 柱效的测定  81-82
          2.3.2.2 分离度  82
          2.3.2.3 校正因子的测定  82
          2.3.2.4 回收率实验  82
          2.3.2.5 精密度实验  82-83
        2.3.3 CLE、PLE中乙醇残留量的测定  83
      2.4 CLE、PLE、TLLE稳定性考察  83-87
        2.4.1 脂质体膜的化学稳定性  83-84
          2.4.1.1 膜材的过氧化值(POV)的测定  83-84
          2.4.1.2 脂质体的pH值  84
        2.4.2 物理稳定性  84-85
        2.4.3 影响因素试验  85-87
        2.4.4 留样观察试验  87
    3.讨论  87-88
  本章小结  88
  参考文献  88-91
第四章：药物动力学和组织分布的研究  91-113
  第一节：药物动力学研究  91-97
    1.仪器与材料  91
      1.1 仪器  91
      1.2 药品与试剂  91
      1.3 实验动物  91
    2.方法与结果  91-96
      2.1 体内血药浓度分析方法的建立  91-92
        2.1.1 血浆样品分析方法  91-92
          2.1.1.1 色谱条件  91
          2.1.1.2 血浆样品处理方法  91-92
      2.2 分析方法确证  92-95
        2.2.1 方法专属性考察  92-93
        2.2.2 标准曲线和线性范围  93-94
        2.2.3 精密度与准确度  94
        2.2.4 萃取回收率  94-95
      2.3 CLE、PLE、TLLE大鼠尾静脉注射的药物动力学研究  95-96
        2.3.1 给药方案及血样采集  95
        2.3.2 数据处理  95
        2.3.3 药动学实验结果  95-96
    3.讨论  96-97
  第二节：组织分布的研究  97-111
    1.仪器与药品  97
    2.方法  97-110
      2.1 组织样品分析方法的建立  97-100
        2.1.1 组织样品分析方法  97
          2.1.1.1 色谱条件  97
          2.1.1.2 组织样品处理方法  97
        2.1.2 分析方法确证  97-100
          2.1.2.1 方法专属性确证  97-98
          2.1.2.2 标准曲线制备  98
          2.1.2.3 精密度、准确度  98
          2.1.2.4 萃取回收率  98-100
      2.2 组织分布研究  100-110
        2.2.1 血浆及组织样品的制备  100
        2.2.2 靶向性评价  100
        2.2.3 统计学处理  100
        2.2.4 组织分布的结果  100-110
          2.2.4.1 非热疗组的组织分布结果  100-104
          2.2.4.2 热疗组的组织分布结果  104-108
          2.2.4.3 热疗组和非热疗组的组织分布比较  108-110
    3.讨论  110-111
  本章小结  111
  参考文献  111-113
第五章：体内外药效学研究  113-131
  第一节：体外抗肿瘤试验  113-119
    1.仪器与材料  113
      1.1 仪器  113
      1.2 药品与试剂  113
      1.3 细胞系  113
    2.实验方法  113-115
      2.1 MTT试验的基本原理  113-114
      2.2 试液的配制  114
        2.2.1 RMP11640培养液配制  114
        2.2.2 PBS配制  114
      2.3 癌细胞的培养  114
      2.4 MTT试验的过程  114-115
      2.5 癌细胞形态变化的观察  115
    3.结果  115-118
      3.1 MTT试验结果  115
      3.2 CoCl在同药物作用后的形态变化  115-118
    4.讨论  118-119
  第二节：体内抗肿瘤实验  119-127
    1.仪器与材料  119-120
      1.1 仪器  119-120
      1.2 药品与试剂  120
      1.3 实验动物  120
      1.4 瘤株  120
    2.方法与结果  120-127
      2.1 瘤细胞(H22)接种方法  120
      2.2 用药剂量的确定  120
      2.3 抑瘤实验方法和结果  120-123
      2.4 组织学检查  123-126
      2.5 体重变化的考察  126-127
    3.讨论  127
  第三节：生命延长百分率试验  127-129
    1.仪器与材料  127
    2.方法与结果  127-128
    3.讨论  128-129
  本章小结  129
  参考文献  129-131
第六章：制剂安全性评价  131-144
  第一节：急性毒性考察  131-133
    1.仪器与材料  131
      1.1 仪器  131
      1.2 药品与试剂  131
      1.3 实验动物  131
    2.实验方法  131-132
    3.实验结果  132
    4.讨论  132-133
  第二节：体外溶血性试验  133-135
    1.仪器与材料  133
      1.1 仪器  133
      1.2 药品与试剂  133
      1.3 实验动物  133
    2.实验方法  133-134
    3.实验结果  134
    4..讨论  134-135
  第三节：过敏试验  135-137
    1.仪器与材料  135
      1.1 仪器  135
      1.2 药品与试剂  135
      1.3 实验动物  135
    2.实验方法  135-136
    3.实验结果  136
    4.讨论  136-137
  第四节：血管局部刺激性试验  137-142
    1.仪器与材料  137
      1.1 仪器  137
      1.2 药品与试剂  137
      1.3 实验动物  137
    2.实验方法  137-138
    3.实验结果  138-142
    4.结论  142
    5.讨论  142
  本章小结  142
  参考文献  142-144
全文结论  144-146
致谢  146-147
作者简介  147-149

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