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T型电压依赖性钙通道在慢性心房颤动的犬及人的肺静脉前庭组织中的表达改变

作　者: 丁文军
导　师: 沈振亚
学　校: 苏州大学
专　业: 胸心血管外科学
关键词: 心房颤动动物模型快速心房起搏犬肺静脉前庭表达水平人类
分类号: R541.75
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

心房颤动(Atrial fibrillation, AF)是临床上最为常见的心律失常,其主要表现为≥400次/分钟的不规则节律的冲动引起心房各部分的快速颤动,它对人类健康的影响不容小觑。不论导致何种并发症,AF均可显著增加患者的致残率和死亡率。它常伴有左心室收缩功能减退和充血性心力衰竭,还可以引起脑血管栓塞。AF可以恶化患者的生活质量,并消耗大量的医疗资源。但由于目前对于AF的发生机制尚不十分清楚,因此目前临床上对AF的治疗尚缺乏有效手段。对于房颤目前存在多种假说,研究热点主要集中于“肺静脉起源学说”。肺静脉前庭(Pulmonary Vein Antrum, PVA)是肺静脉和左房相延续的区域,胚胎发育中由肺静脉与左房融合、吸收逐渐形成,该处肌纤维走行复杂,可呈环形、纵行或斜行排列,不同肌纤维相互交错、各向异性明显,激动在此处传导时存在明显延缓或阻滞。肺静脉及其前庭组织与心房颤动的发生、维持密切相关,深入认识肺静脉前庭区域的组织解剖学特点,对理解心房颤动发生、维持机制,进而指导临床治疗具有重要意义肺静脉之所以被认为是与房颤发生和维持机制关系最为密切的腔静脉,是与其特有的解剖学结构分不开的。研究发现,在肺静脉-左房交接部位,即PVA区域,有心房肌纤维延伸进入肺静脉内,称为心肌袖细胞,其中部分心肌袖细胞具有自律性,而且不应期较短。同时,PVA的心肌纤维排列具有高度的非均一性,是心房内各向异性传导最为显著的部位,不但容易形成致心律失常局灶,而且容易形成肺静脉-左房折返,当快速激动通过这一部位时易导致颤动样传导。来自临床的资料也显示,通过导管消融阻断肺静脉与左房之间的电传导,可以使绝大多数的阵发房颤和部分慢性房颤得到根治。Perez-Lugones等于2003年首次在人类肺静脉内发现起搏细胞(P细胞)和移行细胞。这提示肺静脉可能具有潜在起搏活性。对于P细胞而言,0期缓慢去极化是其起搏功能的基础,现有研究已经证明,慢反应自律细胞的0期缓慢去极化是由电压依赖性T型钙离子通道(Voltage Dependant T-Type Calcium Channel, VDTTCC)在静息状态下缓慢激活所产生,因此,P细胞的起搏活性与电压依赖性T型钙离子通道的分布及功能密切相关。同时,T型钙离子通道还参与了P细胞的细胞内钙离子浓度的调节,而心肌细胞内的“钙超载”以被证明是继发性心房颤动得以产生和维持的重要环节。因此,明确房颤时VDTTCC在肺静脉前庭组织中的表达和分布对于阐明房颤发生的机制很有意义,同时能够对开辟新的临床疗法提供基础证据。本研究着眼于VDTTCC在房颤是PVA区域的表达水平的改变,首先利用快速心房起搏(Rapid Atrial Pacing, RAP)的方法建立慢性心房颤动的动物模型,利用动物模型所获得的PVA标本,在分子生物学及病理形态学两方面研究VDTTCC的表达改变,并在动物实验结论的基础上,谨慎的开展临床观察实验,通过临床获得的PVA标本,对我们的假设及动物实验的结论进行验证。初步的研究发现,VDTTCC在房颤动物及患者的PVA的表达(mRNA转录及通道蛋白表达水平)均较窦性心律对照组显著上调。第一部分经右心房快速起搏法建立犬的慢性房颤模型目的：利用右心房快速起搏的方法建立犬的慢性持续性房颤模型。方法：将实验动物(Beagle犬)共计12只,随机分为实验组及对照组,实验组动物经开胸手术于右心房放置高频电刺激期,频率400-450次/分,对照组动物开胸后于右心房相同部位缝合一针缝线后关胸。实验组持续快速起搏8周,每周记录肢体导联心电图,术前及8周后采集心超数据,计算左右心房长轴面积。结果：所有实验组及对照组12只动物均存活。经过8周心房快速起搏后,所有实验组动物均能诱发出房颤,其中3只动物无须诱发即可维持房颤状态,另3只动物经诱发获得的房颤持续时间52+15min,均符合慢性房颤要求。实验组动物快速起搏后的左右心房面积均显著大于起搏前,而对照组动物则无变化。结论：利用右心房快速起搏的方法可成功建立可自我维持的慢性心房颤动的动物模型。长期的快速心房起搏可明显增加左右心房的面积。第二部分心房颤动时犬的肺静脉前庭组织中T型钙离子通道的表达改变目的：通过人工建立的慢性心房颤动模型获得肺静脉前庭组织,并利用半定量PCR、免疫印迹和免疫组织化学的方法研究电压依赖性T型钙离子通道在PVA区域的表达和分布。方法：安乐死处死实验动物,获取PVA区域组织,洗净血液后分为两部分,分别保存于-80℃冰箱及福尔马林溶液中。针对犬的T型钙离子通道α1H亚基cDNA序列设计引物,用半定量PCR法测定两组PVA组织中该亚基的转录水平,并进行半定量分析。采用免疫印迹法(Western-Blot)测定该亚基蛋白在组织中的含量,并进行半定量分析。对PVA组织进行H-E染色及免疫组织化学染色,并观察比较形态学差异。结果：实验组犬的肺静脉前庭组织中TTCC的α1H亚基的mRNA表达丰度及亚基蛋白的表达水平均较对照组明显升高,H-E染色及免疫组织化学染色结果与前一结论符合,并证实α1H亚基蛋白定位于心肌细胞膜表面。结论：实验组动物的PVA组织中TTCC的表达较对照组显著上调。第三部分心房颤动时人的肺静脉前庭组织中T型钙离子通道的表达改变目的：术中采集慢性心房颤动患者及窦性心律患者的肺静脉前庭组织,并利用实时荧光定量PCR、免疫印迹和免疫组织化学的方法研究电压依赖性T型钙离子通道在PVA区域的表达和分布。方法：所有纳入患者在建立体外循环后、灌注心肌停搏液前,于右上肺静脉放置左房吸引管处预置荷包线并套管,以主动脉打孔器在荷包中心切取少量肺静脉前庭组织(约200mg～400mg),于冰生理盐水中洗净血迹,分为两部分,一部分剪切为小块组织后放入无RNA酶的冻存管中,迅速置入液氮中冷冻,随后转入-80℃深低温冰箱保存；剩下组织放入10%中性福尔马林溶液中固定,留作免疫组化染色用。针对人的T型钙离子通道α1G及α1H亚基cDNA序列设计引物,用实时荧光定量PCR法测定两组PVA组织中两种亚基的转录水平,并进行相对定量分析(2-△△Ct法)。采用免疫印迹法(Western-Blot)测定该亚基蛋白在组织中的含量,并进行半定量分析。对PVA组织进行H-E染色及免疫组织化学染色,并观察比较形态学差异。结果：AF组患者的PVA组织中TTCC的α1H亚基的mRNA表达丰度及亚基蛋白的表达水平均较SR组明显升高,但α1G亚基在两组中的表达水平接近,H-E染色及免疫组织化学染色结果与前一结论符合,并证实α1G、α1H亚基蛋白定位于心肌细胞膜表面。。结论：AF组对比SR组,其T型钙通道α1H亚基表达显著增加,而α1G亚基的表达水平两组间无明显差异。

全文目录

摘要  4-8
Abstract  8-14
第一部分经右心房快速起搏法建立犬的慢性房颤模型  14-23
  前言  14-15
  1 材料与方法  15-17
  2 结果  17-18
  3 讨论  18-21
  4 结论  21
  5 参考文献  21-23
第二部分心房颤动时犬的肺静脉前庭组织中T型钙离子通道的表达改变  23-45
  前言  23-24
  1 材料与方法  24-31
  2 结果  31-39
  3 讨论  39-41
  4 结论  41-42
  5 参考文献  42-45
第三部分心房颤动时人的PVA组织中T型钙离子通道的表达改变  45-76
  前言  45-46
  1 材料与方法  46-54
  2 结果  54-71
  3 讨论  71-73
  4 结论  73
  5 参考文献  73-76
综述  76-86
  参考文献  82-86
英汉缩略词表  86-88
攻读学位期间公开发表的论文  88-89
致谢  89

T型电压依赖性钙通道在慢性心房颤动的犬及人的肺静脉前庭组织中的表达改变

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