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丁草胺降解菌株的分离、降解特性及其生物修复效应

作　者: 郑金伟
导　师: 李顺鹏
学　校: 南京农业大学
专　业: 生物技术
关键词: 氯代乙酰氨类除草剂 生物降解和修复 分离和鉴定 分子结构 生物可降解性 降解产物鉴定 降解途径
分类号: X172
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


氯代乙酰胺类除草剂是一类高效、高选择性的触杀性除草剂,对禾本科杂草具有非常显著的杀除效果,其主要代表品种乙草胺和丁草胺是我国使用最多的三种除草剂中的两种,年使用量分别超过1万吨和5千吨。氯代乙酰胺类除草剂对鱼类有较强的毒性,乙草胺和丁草胺被美国环保局定为B-2类致癌物,它们还有不易挥发、不易光解、土壤残留期长的特点,对生态环境和人体健康有着巨大威胁。另外,氯代乙酰胺类除草剂对作物存在隐性药害,对农业造成严重的损失。因此,该类除草剂在环境中的吸附、迁移、转化和降解等生态行为越来越受到关注。氯代乙酰胺类除草剂在土壤中主要是通过微生物的降解作用而消失,国内外报道了多株该类除草剂降解菌株,但能降解多种氯代乙胺类除草剂并以其为碳源生长的菌株的分离筛选、降解特性和代谢途径方面的研究还不多,其分子结构对其微生物可降解性的影响的研究还未见报道。本文以氯代乙酰胺类除草剂的常用品种丁草胺为降解对象,从长期施用丁草胺的稻田表层土壤及生产丁草胺的农药厂污水处理车间的生化污泥中分离到丁草胺降解菌株14株,其中10株只能以共代谢的方式降解丁草胺,另外4株能以丁草胺作为唯一碳源生长,菌株DCA-1和FLY-8对丁草胺的降解率最高,在无机盐培养基中,DCA-1和FLY-8在5d内对100mg·L-1的丁草胺的降解率为80.3%和68.5%。14株丁草胺降解菌分属于9个不同的属,这一结果显示自然环境中能降解该类除草剂的微生物种类具有丰富的多样性。本文对菌株DCA-1和FLY-8的生物学特性和分类地位进行了详细研究。菌株DCA-1不产芽孢、不运动、严格好氧,革兰氏染色阴性,短杆状不产水溶性色素,未发现内膜结构及光能生长。LB平板上菌落显淡黄色,呈圆形,中间凸起,边缘整齐,不透明。接触酶和氧化酶阳性硝酸盐还原、脲酶、吲哚、产H2S反应显阴性。主要呼吸醌为泛醌10,主要细胞脂肪酸为C18:1ω7c and 11-methyl C18:1ω7c,DNA G+C含量为62.5 mol%。16S rRNA基因同源性及系统发育分析结果表明菌株DCA-1为红球菌科成员,且和Catellibacterium aquatile同源性最近(96.5%),在系统发育树上能很好地聚类成一个分支。根据表型特征、生理生化特性和16S　rRNA基因序列系统发育分析,将其鉴定为Catellibacterium属的一个新种,命名为Catellibacterium caeni sp. nov..菌株FLY-8为不产芽孢、革兰氏染色阴性及不运动的杆菌。最适生长温度为25-30℃,最适pH值为7.0-7.5,最适盐浓度(NaCl)为0.5%。氧化酶、接触酶和硝酸盐还原阳性,脲酶阴性。对庆大霉素和壮观霉素有抗性。DNA G+C含量为62.5 mol%。16S rRNA基因同源性及系统发育分析结果表明菌株FLY-8为副球菌属成员,且和Paracoccus kocurii JCM 7684T (similarity 99.4%)同源性最近,在系统发育树上能很好地聚类成一个分支,将其鉴定为Paracoccus sp.。降解菌株DCA-1能快速降解甲草胺、乙草胺和丁草胺,5d降解率分别达到89.6%、83.2%、75.9%,对异丙草胺也有一定的降解能力,5d降解率为36.4%,并且降解菌株DCA-1能以这四种氯代乙酰胺类除草剂为碳源生长。降解菌株DCA-1不能降解异丙甲草胺和丙草胺。降解菌株FLY-8降解谱要比降解菌株DCA-1的降解谱广,对甲草胺、乙草胺、异丙草胺、丁草胺、丙草胺和异丙甲草胺,5d降解率分别达到98.7%、88.2%、78.3%、65.2%、35.9%和21.4%,并且菌株FLY-8能以这六种氯代乙酰胺类除草剂为碳源生长。菌株DCA-1和FLY-8在温度为20-35℃,pH值为6-9时对丁草胺的降解效果最好。菌株DCA-1和FLY-8对低于100mg·L-1的丁草胺有较好的降解效果；丁草胺浓度超过200mmg·L-1时会对菌株DCA-1和FLY-8产生毒害作用。接种量越大降解效果越好。通气量试验结果表明,在一定转速范围内菌株DCA-1和FLY-8对丁草胺的降解效果随着摇床转速的增加而增加。探讨了氯代乙酰胺类除草剂分子结构对其生物可降解性的影响。结果表明不同烷氧烷基取代对氯代乙酰胺类除草剂的微生物可降解性有非常显著的影响,烷氧甲基取代要比烷氧乙基取代更容易降解；氯代乙酰胺类除草剂分子中的烷氧甲基中烷基的长度对氯代乙酰胺类除草剂的微生物可降解性有明显的影响,烷基链长度越长,降解速率越慢；烷氧甲基中烷基分支结构也影响到其生物可降解性；而氯代乙酰胺类除草剂中苯环上的烷基取代对除草剂的微生物可降解性似乎没有显著影响。通过HPLC和GC-MS技术鉴定了降解菌株DCA-1和FLY-8对丁草胺降解过程中产生的中间代谢产物并对推测了可能的降解代谢途径。推测菌株DCA-1降解丁草胺的代谢途径为：首先丁草胺通过脱去丁氧甲基支链中的丁基,转化为N-hydroxymethyl-2-chloro-N(2,6-diethyl-phenyl)-acctamide (A),然后物质A可以通过脱掉N上的-hydroxymethyl(羟甲基)转化为2,6-二乙基氯代乙酰替苯胺(B),或者A通过脱去氯原子转化为N-(2,6-Diethyl-pheny)-N-hydroxymethyl-acetamide (D);物质D还可以脱掉一个甲基生成N-(2,6-Diethyl-pheny)-N-hydroxymethyl-formamide (E)。丁草胺还可能通过脱氯和脱乙基被直接转化成(2,6-Diethyl-phenyl)-ethoxymethyl-carbamic acid (C).推测菌株FLY-8降解丁草胺的代谢途径为：首先丁草胺脱丙烷基转化为2-chloro-N-(2,6-dimethylphenyl)-N-(methoxymethyl) acetamide (甲草胺),甲草胺进而N原子上脱烷基转化为2-chloro-N-(2,6-dimethylphenyl) acetamide,接着2-chloro-N-(2,6-dimethylphenyl) acetamid又被转化成2,6-diethylaniline,2,6-diethylaniline经过一些列未知方式的降解进一步被转化成了苯胺,苯胺在苯胺双加氧酶的作用下生成邻苯二酚,再在邻苯二酚双加氧酶的作用下开环,最终被完全矿化为二氧化碳和水。通过土壤试验证实微生物降解作用是土壤环境中丁草胺残留降解的主要动力。外源添加丁草胺降解菌株DCA-1能显著促进各类土壤中丁草胺残留的降解,但降解效果受到土壤性质的影响,其中pH值、有机质含量和粘粒含量是相对重要的影响因素,偏中性的pH值,较高的有机质和粘粒含量有利于菌株DCA-1对丁草胺的降解,而淹水状态不利于菌株DCA-1对土壤中丁草胺残留的降解。

全文目录


摘要  10-13
ABSTRACT  13-16
符号与缩略语说明  16-17
第一章 土壤农药污染及其生物修复  17-53
  1 农药使用及其污染现状  17-20
    1.1 农药的定义、性质和类别  17
    1.2 国内外农药的生产、使用情况  17-19
    1.3 农药污染的产生和现状  19-20
  2 农药微生物降解的研究进展  20-26
    2.1 降解机理  21-23
      2.1.1 矿化作用  22
      2.1.2 共代谢作用  22-23
    2.2 降解途径  23-25
    2.3 影响微生物降解的因素  25-26
  3 农药残留生物修复技术研究现状  26-28
    3.1 国内外农药残留生物修复技术研究和应用现状  26-28
      3.1.1 国际上相关技术研究和应用状况  26-27
      3.1.2 国内相关技术研究和应用状况  27-28
  4 氯代乙酰胺类除草剂及其环境行为研究现状  28-40
    4.1 氯代乙酰胺类除草剂使用现状  28-29
    4.2 氯代乙酰胺除草剂残留的危害  29-32
      4.2.1 对哺乳动物的毒性和对人类健康的影响  29
      4.2.2 对水生动物和鱼类的毒害  29-30
      4.2.3 对土壤生态的影响  30-31
      4.2.4 对植物的药害  31-32
    4.3 氯代乙酰胺除草剂的在环境中的物理、化学过程与有效性  32-37
      4.3.1 吸附/解吸  32-33
      4.3.2 迁移  33-34
      4.3.3 光解和水解  34-37
    4.4 氯代乙酰胺除草剂的微生物降解研究进展  37-40
  5 本文拟解决的关键问题、研究思路和内容  40-41
    5.1 要解决的关键问题  40
    5.2 论文研究思路和研究内容  40-41
  参考文献  41-53
第二章 丁草胺降解菌株的分离、筛选和生物学特性研究  53-71
  1 材料与方法  53-58
    1.1 农药和试剂  53
    1.2 培养基  53
    1.3 降解菌的富集和分离  53-54
    1.4 降解菌降解效果的测定  54
    1.5 丁草胺的提取和测定方法  54-55
    1.6 降解菌株的培养特征及一般生理生化鉴定  55
    1.7 核糖体16S rRNA基因序列系统发育分析  55-57
      1.7.1 菌株总DNA的提取  55
      1.7.2 16S rRNA基因的PCR扩增  55-56
      1.7.3 PCR产物的T/A克隆  56
      1.7.4 普通感受态细胞的制备和转化  56
      1.7.5 16S rRNA基因序列测定  56-57
      1.7.6 系统发育分析  57
    1.8 环境条件对菌株生长的影响测定  57-58
      1.8.1 生长温度测定  57
      1.8.2 菌株pH耐受范围和最适pH测定  57
      1.8.3 菌株耐盐性和生长最适盐浓度  57-58
  2 结果与讨论  58-68
    2.1 降解菌株的富集和分离  58-60
      2.1.1 降解菌株富集  58
      2.1.2 以江山农药化工厂生化污泥为富集样品的驯化筛选结果  58-59
      2.1.3 以稻田土壤为富集基质的驯化筛选结果  59-60
    2.2 降解菌株DCA-1和FLY-8的形态和培养特征  60-61
    2.3 降解菌株DCA-1和FLY-8的生理生化特征  61-62
    2.4 菌株DCA-1和FLY-8的16S rRNA基因序列系统进化分析  62-64
    2.5 环境条件对降解菌株DCA-1和FLY-8生长的影响  64-68
      2.5.1 温度对降解菌株DCA-1和FLY-8生长的影响  65
      2.5.2 pH值对降解菌株DCA-1和FLY-8生长的影响  65-66
      2.5.3 NaCl浓度对降解菌株DCA-1和FLY-8生长的影响  66-67
      2.5.4 降解菌株DCA-1和FLY-8的抗生素抗性情况  67-68
  本章小结  68-69
  参考文献  69-71
第三章 丁草胺降解菌株DCA-1分类学地位研究  71-93
  1 材料与方法  71-77
    1.1 菌株和培养基  71-72
    1.2 菌株DCA-1的培养特征及一般生理生化鉴定  72
    1.3 菌体形态和细胞内膜结构观察  72
    1.4 环境条件对菌株生长的影响测定  72-73
      1.4.1 生长温度测定  72
      1.4.2 菌株pH耐受范围和最适pH测定  72
      1.4.3 菌株耐盐性和生长最适盐浓度  72-73
    1.5 细胞色素鉴定  73
    1.6 菌株DCA-1的营养生长试验  73
      1.6.1 化能厌氧生长试验  73
      1.6.2 光能营养生长试验  73
    1.7 碳源利用试验  73
    1.8 API 20 NE检测  73-74
    1.9 API ZYM检测  74
    1.10 细胞壁脂肪酸分析  74-75
    1.11 呼吸醌系统分析  75
    1.12 G+C mol%的测定  75-76
      1.12.1 菌体总DNA的提取  75-76
      1.12.2 变温熔链法测定G+C mol%  76
    1.13 16S rRNA基因的系统发育分析  76-77
  2 结果与分析  77-89
    2.1 菌株DCA-1的细胞泡状内膜结构观察  77
    2.2 生理生化特征  77-81
      2.2.1 细胞色素鉴定  77-78
      2.2.2 营养类型研究  78-79
      2.2.3 不同碳源利用  79
      2.2.4 API 20 NE测定结果  79-80
      2.2.5 API ZYM测定结果  80-81
    2.3 菌株DCA-1的表型特征  81-82
    2.4 菌株DCA-1与相近模式种的表型差异分析  82-84
    2.5 细菌化学分类  84-85
      2.5.1 细胞壁脂肪酸分析  84-85
      2.5.2 类异戊二烯醌分析  85
    2.6 G+C含量测定  85
    2.7 16S rRNA基因的遗传进化分析  85-88
    2.8 结论和新种描述(附英文对照)  88-89
  本章小结  89-90
  参考文献  90-93
第四章 丁草胺降解菌DCA-1和FLY-8的降解特性研究  93-105
  1 材料与方法  93-94
    1.1 供试菌株  93
    1.2 化学试剂  93
    1.3 培养基  93
    1.4 菌株的培养及种子液的制备  93
    1.5 培养液中除草剂的提取和检测  93-94
    1.6 菌株DCA-1和FLY-8生长与除草剂降解的关系  94
    1.7 温度对DCA-1和FLY-8降解丁草胺的影响  94
    1.8 pH值对DCA-1和FLY-8降解丁草胺的影响  94
    1.9 初始丁草胺浓度对DCA-1和FLY-8生长的影响  94
    1.10 接种量对DCA-1和FLY-8降解丁草胺的影响  94
    1.11 通气量对DCA-1和FLY-8降解丁草胺的影响  94
  2 结果与分析  94-102
    2.1 菌株DCA-1和FLY-8对多种氯代乙酰胺类除草剂降解情况  94-99
    2.2 温度对菌株DCA-1和FLY-8降解丁草胺的影响  99
    2.3 初始pH对菌株DCA-1和FLY-8降解丁草胺的影响  99-100
    2.4 初始丁草胺浓度对菌株DCA-1和FLY-8降解丁草胺的影响  100-101
    2.5 接种量对菌株DCA-1和FLY-8降解丁草胺的影响  101
    2.6 通气量对菌株DCA-1和FLY-8降解丁草胺的影响  101-102
  本章小结  102-103
  参考文献  103-105
第五章 菌株DCA-1与FLY-8降解丁草胺的代谢途径分析  105-119
  第一节 菌株DCA-1降解丁草胺途径的分析  105-110
    1 材料与方法  105-106
      1.1 供试菌株、试剂、培养基  105-106
      1.2 培养液制备  106
      1.3 丁草胺代谢产物的提取  106
      1.4 GC-MS检测代谢产物  106
    2 结果与分析  106-110
      2.1 代谢产物的GC-MS检测  106-109
      2.2 菌株DCA-1降解丁草胺的可能途径  109-110
  第二节 菌株FLY-8降解丁草胺途径的分析  110-116
    1 材料与方法  110-112
      1.1 供试菌株、试剂、培养基  110-111
      1.2 培养液制备  111
      1.3 丁草胺代谢产物的提取  111
      1.4 GC-MS检测代谢产物  111
      1.5 下游代谢产物的酶活分析  111-112
    2 结果与分析  112-116
      2.1 代谢产物的GC-MS检测  112-114
      2.2 粗酶酶活检测下游代谢产物  114-115
      2.3 推测FLY-8降解丁草胺的代谢途径  115-116
  本章小结  116-117
  参考文献  117-119
第六章 菌株DCA-1对丁草胺污染土壤的生物修复研究  119-129
  1 材料与方法  119-121
    1.1 农药和试剂  119
    1.2 菌种与培养基  119
    1.3 降解菌株DCA-1种子液的制备  119
    1.4 供试土壤  119-120
    1.5 土壤中丁草胺的提取  120
    1.6 丁草胺的测定  120-121
    1.7 菌株DCA-1对土壤中丁草胺残留的降解试验  121
    1.8 土壤淹水条件下菌株DCA-1对土壤中丁草胺残留的降解  121
  2 结果与讨论  121-126
    2.1 丁草胺测定的回收率和标准曲线绘制  121-122
      2.1.1 丁草胺的提取回收率  121-122
      2.1.2 丁草胺测定的标准曲线绘制  122
    2.2 菌株DCA-1对不同土壤中丁草胺残留的降解效果  122-125
    2.3 淹水状态对菌株DCA-1降解土壤中丁草胺残留的影响  125-126
  本章小结  126-127
  参考文献  127-129
全文总结  129-131
全文创新点  131-133
附录1 文中所用培养基及试剂配方  133-135
附录2 有关核酸序列  135-137
附录3 菌种保藏证明  137-139
攻读博士学位期间发表的文章  139-141
致谢  141

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