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杀螟硫磷重组单链抗体研究

作　者: 罗义辉
导　师: 夏玉先
学　校: 重庆大学
专　业: 植物学
关键词: 杀螟硫磷 有机磷农药 抗原 核糖体展示 单链抗体 Biacore
分类号: S481.8
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


基因工程抗体(genetically engeering antibody)是人们利用基因重组技术,在基因水平上对抗体分子进行有目的切割、拼接、修饰,或直接进行基因序列合成,再将重组基因导入受体细胞表达产生出的一类抗体。其中单链抗体(singe-chain variable fragment,ScFv)已被广泛应用于医学领域,因为它具有低或无免疫原性、组织穿透力强、相对分子质量小、可大规模生产等特点。单链抗体制备方法有核糖体展示技术和噬菌体展示技术等。其中核糖体展示技术由于具有库容量远比噬菌体展示文库大、完全在体外进行、建库和筛选方法简便等优点,并且还可通过突变或重组技术来提高重组抗体的亲和力,因而显示出了诱人的发展前景。有机磷农药(Organophosphorus pesticides)是我国目前在农业生产上使用较多的一类化学农药,农产品上有机磷农药的残留直接危害人们身体健康。必须对农产品中的有机磷残留进行严格检测。目前对这类农药的残留分析一般采用气相色谱法等仪器分析法检测。但这些方法必须对样品进行复杂的纯化处理,且操作者必须经过严格的专业培训,不适合现场操作。近年来,被广泛用于小分子化合物定量分析的免疫分析法为有机磷农药残留的快速检测提供了可能,获得高亲和力和高特异性且廉价的抗体是免疫分析操作的关键,目前还没有应用核糖体展示技术制备抗有机磷的高亲和力单链抗体的报道。本研究利用核糖体展示技术筛选具有高亲和力和高特异性的抗杀螟硫磷的重组单克隆抗体。本研究用杀螟硫磷-BSA免疫BALB/c小鼠,构建了抗杀螟硫磷单链抗体文库,用杀螟硫磷-OVA作为筛选抗原,应用核糖体展示技术筛选特异于杀螟硫磷的单链抗体,然后将筛选的单链抗体基因表达、纯化,并研究其特异性与亲和力。制备的重组单链抗体为杀螟硫磷的快速检测奠定了基础,该单链抗体可用于杀螟硫磷的ELISA(酶联免疫分析)检测,也可用于杀螟硫磷的免疫传感器的制备。主要研究结果如下:①用重氮化法分别合成了免疫抗原杀螟硫磷-BSA和筛选抗原杀螟硫磷-OVA。②利用杀螟硫磷-BSA免疫BALB/c小鼠,免疫后小鼠抗血清效价为2500倍左右,符合建库要求。③提取小鼠脾细胞RNA,经RT-PCR构建的单链抗体文库轻链为700bp左右,重链为400bp左右,经连接肽连接后所得到的单链抗体大小约为1.1kb。测序结果表明,单链抗体序列为开放阅读框。它们的的互补决定区都互不相同,说明所构建的ScFv文库多样性好,可进行下一步的单链抗体的筛选。④将构建的ScFv文库经体外转录/翻译后,产生了三元复合体(单链抗体-核糖体-mRNA,ARM)文库。用杀螟硫磷-OVA对产生的ARM三元复合体进行亲和筛选,洗涤后,使保留的三元复合体解离,再对释放的mRNA进行RT-PCR扩增获得筛选后的ScFv DNA文库,重复上述过程,得到经三轮筛选后的ScFv DNA文库。⑤将原始ScFv文库DNA和经过三轮筛选的ScFv文库DNA分别与噬菌体表达载体pPOW3.0相连接后,转入大肠杆菌DH5α中表达。然后后用间接ELISA分析单链抗体与杀螟硫磷-OVA的结合活性。结果表明从原始ScFv文库中随机挑取的50个克隆子的表达产物与杀螟硫磷-OVA几乎没有结合能力;而从经过三轮筛选后的ScFv文库中挑取的100个克隆子中有25%与杀螟硫磷-OVA有较好的结合能力。从三轮筛选后的ScFv文库中共挑取了190个克隆子,用间接ELISA法初筛到50株抗原阳性的ScFv。然后用生物传感技术对ELISA筛选呈阳性的ScFv进行了复筛,获得了3株高亲和力的单链抗体(ScFv-AF50、ScFv-AF93和ScFv-AF132),用于下一步的表达、纯化和分析。⑥将筛选的抗原阳性ScFv进行了特性研究。单链抗体(ScFv-AF50、ScFv-AF93和ScFv-AF132)特异性强、亲和力高。杀螟硫磷对它们的IC50分别为1.6、3.4和2.2 ng/ ml,检测限分别是0.02、0.07和0.01 ng/ml。它们与其它有机磷(甲基对硫磷、乙酰甲胺磷、马拉硫磷、乐果、三唑磷、毒死蜱)交叉反应低,除了与甲基对硫磷有一定的交叉反应(≤2.8%),其余的均小于0.1%。Biacore分析其亲和力表明,单链抗体ScFv-AF50、ScFv-AF93和ScFv-AF132的解离平衡常数分别为4.56×10-10 M、1.42×10-9 M和2.66×10-10 M。⑦分析了ScFv基因的序列特征。IMGT(international immunogenetics database)软件分析单链抗体DNA序列,表明单链抗体scFv-AF50和AF132重链属于VH4基因家簇, scFv-AF93重链属于VH1基因家簇;三株单链抗体的轻链均属于Vk IV亚基因家簇。序列同源性通过basic local alignment search tool (BLAST)软件分析,表明scFv-AF50和AF93重链有97%的同源性,scFv-AF50和AF132轻链有89%的同源性。⑧以我们筛选的ScFv-AF132为抗体蛋白,以竞争ELISA进行了稻米和黄瓜中杀螟硫磷的添加回收率的实验,并与气相色谱进行了比较,ELISA法的回收率在80.6%-108%之间,而GC法则在64%-91%之间,两方法的相对误差无明显差异。

全文目录


中文摘要  3-5
英文摘要  5-12
缩略词  12-13
1 绪论  13-37
  1.1 有机磷农药残留检测技术的研究进展  13-18
    1.1.1 样品的前处理技术  13-16
    1.1.2 农药残留的仪器检测法  16-17
    1.1.3 农药残留的快速检测法  17-18
  1.2 抗体简介  18-31
    1.2.1 抗体的基本结构  18-19
    1.2.2 ScFv 基因的构建  19-20
    1.2.3 抗体基因库技术  20-27
    1.2.4 单链抗体的表达  27-29
    1.2.5 抗体的纯化  29
    1.2.6 ScFv 存在问题及改进方法  29-31
  1.3 立题依据  31-33
  1.4 本研究的目标和内容  33-34
  1.5 整体设计思路  34-35
  1.6 创新之处  35-37
2 杀螟硫磷抗原合成与鉴定  37-43
  2.1 技术路线  37
  2.2 实验材料  37
    2.2.1 主要仪器  37
    2.2.2 主要试剂  37
  2.3 实验方法  37-39
    2.3.1 杀螟硫磷半抗原的合成  37-38
    2.3.2 杀螟硫磷半抗原的纯化  38
    2.3.3 杀螟硫磷抗原的合成  38-39
  2.4 结果与分析  39-41
    2.4.1 人工抗原的合成与鉴定  39-40
    2.4.2 小分子与载体蛋白结合比的测定  40-41
  2.5 讨论  41-43
    2.5.1 半抗原的设计与合成  41-42
    2.5.2 载体的选择  42
    2.5.3 人工抗原的合成  42-43
3 单链抗体文库的构建  43-63
  3.1 技术路线  43
  3.2 实验材料  43-45
    3.2.1 主要仪器  43-44
    3.2.2 主要试剂  44-45
  3.3 实验方法  45-52
    3.3.1 免疫小鼠  45-46
    3.3.2 小鼠抗血清效价的测定  46
    3.3.3 分离小鼠脾细胞  46-47
    3.3.4 脾细胞总 RNA 的提取  47
    3.3.5 VH、VL 的扩增  47-50
    3.3.6 ScFv 文库质量的评价  50-52
  3.4 结果与分析  52-58
    3.4.1 小鼠免疫  52
    3.4.2 脾细胞RNA 质量测定  52-53
    3.4.3 RT-PCR 扩增VH 和VL  53-54
    3.4.4 VH 与 VL 片段的连接  54-55
    3.4.5 单链抗体文库质量评价  55-58
  3.5 讨论  58-63
    3.5.1 免疫小鼠  58
    3.5.2 总 RNA 的提取  58-59
    3.5.3 ScFv 文库重链和轻链的扩增  59-60
    3.5.4 重链与轻链的连接  60-63
4 核糖体展示  63-71
  4.1 技术路线  63
  4.2 实验材料  63-64
    4.2.1 主要仪器  63
    4.2.2 主要试剂  63-64
  4.3 实验方法  64-65
    4.3.1 体外转录/翻译  64
    4.3.2 亲和筛选  64-65
  4.4 结果与分析  65-67
    4.4.1 体外无细胞翻译系统  65-66
    4.4.2 RT-PCR 扩增  66-67
  4.5 讨论  67-71
    4.5.1 体外转录与翻译  67-68
    4.5.2 亲和筛选  68-69
    4.5.3 RT-PCR 扩增  69-71
5 单链抗体的克隆及筛选  71-87
  5.1 技术路线  71
  5.2 实验材料  71-72
    5.2.1 主要仪器  71
    5.2.2 主要试剂  71-72
  5.3 实验方法  72-77
    5.3.1 筛选后单链抗体库DNA 的扩增  72-73
    5.3.2 全套ScFv 基因的克隆  73-75
    5.3.3 ScFv 的表达  75
    5.3.4 ELISA 筛选单链抗体  75
    5.3.5 Biacore 筛选高亲和力单链抗体  75-77
  5.4 结果与分析  77-83
    5.4.1 阳性克隆子的验证  77-78
    5.4.2 单链抗体的表达  78
    5.4.3 筛选阳性克隆子  78-80
    5.4.4 Biacore 筛选高亲和力抗体  80-83
  5.5 讨论  83-87
    5.5.1 ELISA 初筛抗原阳性单链抗体  83-84
    5.5.2 Biacore 筛选高亲和力ScFv  84-87
6 单链抗体的表达及特性研究  87-99
  6.1 技术路线  87
  6.2 实验材料  87-89
    6.2.1 主要仪器  87-88
    6.2.2 主要试剂  88-89
  6.3 实验方法  89-91
    6.3.1 ScFv 表达产物的纯化  89-90
    6.3.2 SDS-PAGE 电泳分析表达蛋白  90
    6.3.3 ELISA 测定单链抗体亲和力和专一性  90-91
    6.3.4 单链抗体亲和力测定  91
    6.3.5 序列测定及分析  91
  6.4 结果与分析  91-96
    6.4.1 单链抗体的纯化  91-92
    6.4.2 ELISA 分析单链抗体专一性  92-93
    6.4.3 Biacore 系统分析单链抗体亲和力  93-95
    6.4.4 单链抗体序列分析  95-96
  6.5 讨论  96-99
    6.5.1 单链抗体表达与纯化  96-97
    6.5.2 抗体特性研究及序列分析  97-99
7 样本添加回收率测定  99-103
  7.1 技术路线  99
  7.2 实验材料  99
    7.2.1 主要仪器  99
    7.2.2 主要试剂  99
  7.3 实验方法  99-100
  7.4 结果与分析  100-101
  7.5 讨论  101-103
8 主要研究结论及后续研究建议  103-105
  8.1 主要研究结论  103-104
  8.2 后续工作建议  104-105
致谢  105-107
参考文献  107-117
附录  117

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 农药防治（化学防治） > 植物化学保护理论 > 农药残毒
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