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急性应激对大鼠脑中脱落酸变化的影响

作　者: 张智
导　师: 周江宁
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 神经生物学
关键词: 脱落酸强迫游泳急性束缚应激促肾上腺皮质激素释放因子免疫组化
分类号: Q42
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

脱落酸(Abscisic Acid,ABA)是植物中广泛存在的一种调节激素,它在植物种子休眠、幼苗生长发育、多种生物(如病原菌)和非生物(干旱、寒冷和高盐等)应激过程中都起到重要调控作用。近年来,越来越多的研究发现许多动物中也存在ABA,包括海绵、水螅、人寄生虫和多种哺乳动物组织和细胞,并参与相应的应激反应、组织生长、炎症调节、糖代谢等信号调节通路中。ABA在这些通路中的信号作用方式与植物类似,首先ABA与细胞膜上的特异性蛋白结合,激活ADP核糖环化酶,从而提升胞内cADPR的表达,增加胞内Ca2+浓度,并进一步激活一系列下游信号反应。这些发现表明ABA可能作为一个普遍的信号分子,广泛参与调节植物和动物对环境的应激反应。本实验建立了动物脑组织中ABA的提取和检测方法,研究了大鼠不同脑区ABA含量的特异性分布。结果发现,ABA在前额叶、左右海马和下丘脑不同脑区的含量不同,其中以下丘脑中含量最高,为18.1±1.9ng/g组织鲜重。实验进一步以强迫游泳和束缚两种急性应激方式,研究了大鼠大脑中ABA含量随应激的变化。结果表明,在前额叶和海马中,急性束缚1小时后ABA含量约增加到对照组2倍水平,而下丘脑ABA含量却明显下降。另外,不同应激条件下,下丘脑内ABA的变化趋势与前额叶和海马相反。急性应激下,大鼠血浆皮质酮水平、下丘脑CRF和c-fos的基因表达上调。相关性分析显示,c-fos的表达变化与皮质酮的水平变化呈正相关,与下丘脑ABA水平变化呈负相关。这些结果显示,大鼠大脑中存在ABA,下丘脑可能是ABA的分泌或作用中心,而且ABA信号在下丘脑与其他脑区的可能作用方式或时间尺度存在差异。生物信息学手段对ABA植物中重要信号蛋白ABI1、ABI3和ABRE/ABF的比对检索发现,人源蛋白PPM1B、RNC3和ATF6与上述分子具有高度相似的氨基酸序列,相似度分别为49%,39%,60%。对筛选出的假定人ABA相关蛋白的mRNA表达研究显示,24小时20μM ABA培养神经元母细胞瘤细胞系BE(2)-C能显著降低以上蛋白的表达。我们推测这些候选蛋白和ABA的信号通路存在某种直接或间接的交叉关联。为探索ABA在组织和细胞中的定位情况,进行了ABA免疫组织化学和细胞免疫荧光实验。巨噬细胞ABA免疫荧光染色结果显示,ABA主要定位于细胞膜和胞浆,无特异性胞核着色。这与前述细胞内ABA的作用方式和早期玉米中ABA免疫组化结果吻合。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-10
第1章植物激素脱落酸在动物中的研究进展（综述）  10-22
  1.1 植物激素脱落酸概述  10-14
    1.1.1 脱落酸介绍  10-12
    1.1.2 脱落酸的功能和信号通路  12-14
  1.2 脱落酸在动物中的研究进展  14-19
    1.2.1 动物中存在脱落酸  14-18
    1.2.2 脱落酸在动物中的应激通路  18-19
  1.3 脱落酸的潜在临床应用  19-22
第2章脱落酸与大鼠急性应激  22-40
  2.1 引言  22
  2.2 实验材料与方法  22-29
    2.2.1 大鼠急性应激及取材  22-23
    2.2.2 ABA 的组织提取  23-24
    2.2.3 ABA 放射性免疫分析（RIA）  24-25
    2.2.4 ABA 酶联免疫分析（ELISA）  25-27
    2.2.5 组织RNA 提取及实时荧光定量PCR（Q-PCR）  27-29
    2.2.6 统计与作图  29
  2.3 实验结果  29-33
    2.3.1 急性应激大鼠皮血浆质酮变化  29-30
    2.3.2 不同脑区ABA 含量变化  30-31
    2.3.3 不同应激大鼠ABA 含量  31-32
    2.3.4 RNA 抽提质量验证  32-33
    2.3.5 应激大鼠下丘脑CRF 及c-fos 表达变化  33
  2.4 实验讨论  33-38
    2.4.1 ABA 提取和检测方法的建立.  33-34
    2.4.2 急性应激对大鼠皮质酮水平的影响  34-35
    2.4.3 ABA 在大鼠脑组织中的区域分布探讨.  35-36
    2.4.4 新RNA 抽提方法效果讨论  36
    2.4.5 ABA 与中枢应激信号分子的相关性探讨.  36-38
  2.5 总结与展望  38-40
第3章脱落酸的信号通路探索  40-46
  3.1 引言  40
  3.2 实验材料与方法  40-42
    3.2.1 细胞培养与ABA 给药  40-41
    3.2.2 RNA 提取与实时定量荧光PCR  41
    3.2.3 BLAST 检索与通路蛋白筛选  41-42
  3.3 实验结果  42-43
    3.3.1 ABA 信号相关蛋白比对  42
    3.3.2 ABA 影响下筛选蛋白的基因表达变化  42-43
  3.4 实验讨论  43-46
    3.4.1 ABA 信号通路蛋白检索  43-44
    3.4.2 假定的人ABA 相关蛋白功能分析  44-46
第4章脱落酸免疫组化  46-56
  4.1 引言  46
  4.2 实验材料与方法  46-52
    4.2.1 ABA 大鼠石蜡切片  46-49
    4.2.2 ABA 石蜡切片免疫组化  49-51
    4.2.3 ABA 细胞免疫荧光  51-52
  4.3 实验结果  52-55
    4.3.1 ABA 大鼠石蜡切片免疫组化  52-54
    4.3.2 ABA 细胞免疫荧光  54-55
  4.4 实验讨论  55-56
    4.4.1 ABA 脑组织免疫组化  55
    4.4.2 ABA 细胞免疫荧光  55-56
参考文献  56-66
附录  66-68
致谢  68-70
在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果  70

急性应激对大鼠脑中脱落酸变化的影响

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