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北京油鸡部分重要形状基因克隆及purh基因3种表达载体构建

作　者: 包阿东
导　师: 曹贵方；关伟军
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 北京油鸡成纤维细胞 PURH基因荧光蛋白
分类号: S831
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 35次
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内容摘要

利用RT-PCR方法扩增PURH、CD3δ、CD3ε、CD8α、IFNαreceptor1、IFNαreceptor2、IFNγreceptor2、RBMX、PEPD、WRB等10个基因。采用组织块贴壁培养法,成功地构建北京鸡成纤维靶细胞系。提取北京油鸡心、肝、脾、肺、肾、脑、腿肌与胸肌等不同组织的总RNA,检测PURH基因mRNA的差异表达水平。将PURH基因完整开放阅读框重组至真核表达载体pEGFP-N3,pEYFP-N1及pDsRed1-N1,成功构建带有报告基因的3种真核重组表达载体。脂质体介导导入北京油鸡体外培养成纤维细胞中,对PURH基因的时空表达、亚细胞定位、阳性细胞生长、增殖状况、细胞活力以及提高基因表达率的最佳方法等方面进行了深入的研究;并利用G418药物筛选和对荧光强度高的单克隆化培养。实验结果如下:1.将10个基因侧序后提交Genbank。2.根据ATCC的细胞库鉴定内容与评价标准,对所构建细胞系进行了生物学性状研究、鉴定和综合评价,所得结果显示未发生物种间细胞的交叉污染和恶性转化,遗传性能稳定。3.在转染后24、48和72h,重组融合蛋白转染率在10.3%-53.2%之间。pEGFP-N3-PURH,pEYFP-N1-PURH与pDsRed1-N1-PURH在北京油鸡成纤维细胞的细胞核与细胞质均有分布,呈弥散分布。经药物筛选和单克隆化培养,获得表达pEGFP-N3-PURH,pEYFP-N1-PURH与pDsRed1-N1-PURH融合蛋白的阳性克隆细胞株,经RT-PCR扩增与Western blot检测确认了PURH融合蛋白基因已经整合到北京油鸡成纤维细胞的基因组中,获得正常表达。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
1 引言  8-19
  1.1 国内外畜禽遗传资源现状  8
  1.2 畜禽种质资源的利用  8-9
  1.3 转基因技术  9-15
    1.3.1 转基因方法概述  10-12
    1.3.2 利用转基因技术对我国地方鸡种优良性状的改良  12-14
    1.3.3 荧光蛋白在转基因技术中的应用  14-15
  1.4 动物细胞培养技术  15-18
    1.4.1 体外培养细胞的方法及过程  15-16
    1.4.2 体外细胞的原代和继代培养  16
    1.4.3 培养细胞的冻存与复苏  16
    1.4.4 细胞系的检测  16-17
    1.4.5 细胞培养的应用  17-18
  1.5 部分重要性状基因克隆保存的价值及意义  18-19
2 实验一北京油鸡部分重要性状基因克隆  19-30
  2.1 材料与方法  19-26
    2.1.1 材料  19-23
    2.1.2 实验方法  23-26
  2.2 实验结果  26-29
    2.2.1 不同组织总 RNA 提取  26
    2.2.2 RT-RCR  26-27
    2.2.3 PURH 基因在不同组织中的分布  27
    2.2.4 序列提交 Genbank  27-29
  2.3 讨论  29-30
    2.3.1 全长 PURH 基因cDNA 序列及其编码氨基酸序列分析  29
    2.3.2 北京油鸡 PURH 基因cDNA 全序列 SNP 多态性分析  29-30
3 实验二北京油鸡成纤维靶细胞系构建及检测  30-38
  3.1 实验方法  30-33
    3.1.1 细胞培养  30-31
    3.1.2 细胞检测  31-33
  3.2 结果  33-37
    3.2.1 细胞培养  33-34
    3.2.2 细胞检测结果  34-37
  3.3 讨论  37-38
4 实验三北京油鸡PURH 基因的表达载体构建  38-47
  4.1 实验方法  38-40
    4.1.1 北京油鸡 PURH 真核表达载体的构建  38
    4.1.2 脂质体介导法转染成纤维细胞及 PURH 基因的亚细胞分布.  38-39
    4.1.3 G418 北京油鸡成纤维细胞最小致死量测定与抗性细胞的筛选  39
    4.1.4 单克隆阳性细胞株荧光蛋白基因整合、表达的检测及鉴定  39
    4.1.5 PURH 在北京油鸡成纤维细胞中表达检测  39-40
  4.2 结果  40-44
    4.2.1 PURH 真核表达载体的构建  40
    4.2.2 pEGFP-N3-PURH 转染条件的优化  40-41
    4.2.3 重组外源基因转染率的比较  41-42
    4.2.4 北京油鸡 PURH 基因的亚细胞定位  42-43
    4.2.5 克隆化细胞株的筛选  43-44
    4.2.6 阳性细胞株的鉴定  44
    4.2.7 Western blot 检测在北京油鸡成纤维细胞中表达的重组融合蛋白  44
  4.3 讨论  44-47
    4.3.1 影响pEGFP-N3－PURH 转染表达的各种因素  44-45
    4.3.2 PURH 在细胞中的定位  45
    4.3.3 北京油鸡成纤维细胞pEGFP-N3，pEYFP-N1 及pDsRed1-N1 阳性细胞株的建立  45-46
    4.3.4 北京油鸡成纤维细胞中表达的重组融合蛋白检测  46-47
致谢  47-48
参考文献  48-52
附录  52-62
作者简介  62

北京油鸡部分重要形状基因克隆及purh基因3种表达载体构建

内容摘要

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