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siRNA阻断Ⅰ型PI3K信号传导通路对人胃癌SGC7901细胞的影响

作　者: 郁立衍
导　师: 邢春根
学　校: 苏州大学
专　业: 外科学
关键词: Ⅰ型PI3K siRNA 增殖 凋亡 自噬
分类号: R735.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 32次
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内容摘要


目的:扩增含有能特异性阻断Ⅰ型PI3K信号传导通路的小干扰RNA（small interferning RNA , siRNA ）重组质粒的重组腺病毒PI3K（Ⅰ）-RNAi-AD ,利用PI3K（Ⅰ）-RNAi-AD特异性地阻断Ⅰ型PI3K信号传导通路后,观察其对人胃癌SGC7901细胞增殖、凋亡和自噬的影响。方法:①利用293T细胞扩增重组腺病毒PI3K（Ⅰ）-RNAi-AD及对照腺病毒NC-RNAi-GFP-AD并测定其滴度,同时测定PI3K（Ⅰ）-RNAi-AD对人胃癌SGC7901细胞的最佳感染复数;②重组腺病毒PI3K（Ⅰ）-RNAi-AD转染人胃癌SGC7901细胞24h、48h、72h作为实验组,对照腺病毒NC-RNAi-GFP-AD转染人胃癌SGC7901细胞72h作为对照组（MTT中对照组为NC-RNAi-GFP-AD转染细胞24h、48h和72h）。③利用PI3K（Ⅰ）-RNAi-AD转染人胃癌SGC7901细胞,siRNA阻断Ⅰ型PI3K信号传导通路后,采用MTT法测定其对SGC7901细胞增殖的抑制作用,应用流式细胞技术JC-1法检测其对SGC7901细胞线粒体膜电位的影响,应用MDC荧光染色法及透射电镜观察自噬的发生,Western blot测定自噬特异性蛋白微管相关蛋白1轻链3 （microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3）表达,计算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值反映细胞自噬水平。结果:①大量扩增得重组腺病毒PI3K（Ⅰ）-RNAi-AD及对照腺病毒NC-RNAi-GFP-AD,并测得两者的滴度分别为1.0×1011 pfu/L和0.9×1011 pfu/L,腺病毒对胃癌SGC7901细胞感染复数（multiple of infection,MOI）为50时转染效果最好。②PI3K（Ⅰ）-RNAi-AD转染胃癌SGC7901细胞后胃癌SGC7901细胞的增殖明显受到抑制,24h、48h、72h抑制率分别为27.48%±2.7%、41.92%±2.02%、50.85%±0.92%;流式细胞术检测结果显示实验组绿色荧光的细胞占总细胞的比值24h、48h、72h分别为18.5%±1.64%、39.5%±1.70%、55.8%±1.86%,对照组为12.6%±1.11% （P<0.05）,绿色荧光的细胞数量占总细胞数的比值越大,线粒体膜电位就越低;MDC荧光染色及透射电镜观察结果显示:实验组随着时间延长（24h、48h、72h）自噬囊泡逐渐增多,对照组自噬囊泡比实验组各组都少;LC3的表达实验组24h、48h、72h LC3II/LC3I比值分别为0.293±1.481%、0.488±1.199%、0.889±1.190%,而对照组比值为0.123±1.225% （P<0.05）。结论:①成功扩增的重组腺病毒PI3K（Ⅰ）-RNAi-AD滴度达1.0×1011 pfu/L;腺病毒对人胃癌SGC7901细胞的最佳感染复数为50。②siRNA阻断Ⅰ型PI3K信号传导通路后胃癌SGC7901细胞的增殖明显受抑制,细胞凋亡明显增强,自噬水平明显上调。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-9
前言  9-11
材料与方法  11-24
  一 材料  11-13
  二 方法  13-24
结果  24-32
  一 PI3K(I)-RNAi-AD、NC-RNAi-GFP-AD 滴度及对 SGC7901 细胞最佳 感染复数  24
  二 PI3K(I)-RNAi-AD 对胃癌 SGC7901 细胞增殖的抑制作用  24-26
  三 PI3K(I)-RNAi-AD 对胃癌 SGC7901 细胞线粒体膜电位的影响  26-27
  四 MDC 荧光染色检测 PI3K(I)-RNAi-AD 对胃癌 SGC7901 细胞自噬的 影响  27-28
  五 透射电镜观察 PI3K(I)-RNAi-AD 作用后胃癌 SGC7901 细胞自噬变化  28-30
  六 PI3K(I)-RNAi-AD 对胃癌 SGC7901 细胞 LC3 蛋白表达的影响  30-32
讨论  32-35
参考文献  35-37
结论  37-38
综述  38-57
  参考文献  51-57
攻读学位期间公开发表的论文  57-58
中英文对照缩略词表  58-59
致谢  59-60

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 胃肿瘤
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