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肠道病毒71型VP1基因及2A基因和蛋白质特征

作　者: 范张洁
导　师: 段广才
学　校: 郑州大学
专　业: 流行病与卫生统计学
关键词: 肠道病毒71型 VP1基因 2A基因同源性系统发生树蛋白结构模拟图
分类号: R373
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

肠道病毒71型(Enterovirus71, EV71)属于小RNA病毒科肠道病毒属,感染后可以导致手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样麻痹性疾病、神经源性肺水肿等多种与神经系统相关的疾病。近几年在亚太地区的大流行中,出现严重中枢神经系统感染病例,甚至死亡病例,因此有关EV71病毒的致病性、致病机理、诊断及疫苗方面的研究日益受到重视。国家卫生部已于2008年5月2日决定,将手足口病纳入传染病防治法规定的丙类传染病进行管理。EV71为什么会导致少数重症甚至死亡病例的出现,毒力决定因子有哪些9EV71的VP1基因编码的蛋白质是病毒重要的中和抗原决定簇,VP1基因序列除了是肠道病毒属内不同血清型分类的依据,还可以作为小RNA病毒科内不同属的分类参考。研究表明EV71的11个病毒蛋白中,对酵母菌产生毒性的只有2A蛋白,而2A蛋白是水解酶,在正常的生理意义下,哺乳细胞被肠病毒感染后,宿主的生长会受到抑制,其中一个机制就是：2A蛋白切割分解宿主的真核生物起始因子4G (eIF4G, eukaryotic translation initiation factor 4G),因而抑制宿主蛋白质合成。也有报道指出,小儿麻痹病毒的2A蛋白会抑制酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的细胞生长,可能的原因是2A切割了一些用来进行转录的蛋白质因子。短暂的表达EV71 2A蛋白酶引起细胞凋亡,感染表达的EV71 2A会导致eIF4G I的裂解,而eIF4GI是宿主蛋白合成的关键因素。目的本课题旨在研究肠道病毒71型轻症和重症病例毒株VP1基因、2A基因的核苷酸序列及预测的2A蛋白质结构特征及是否有差别。方法通过RD细胞分离病毒,然后RT-PCR鉴别诊断EV71,分别扩增VPl、2A基因并进行核苷酸序列测定,用DNAMAN软件进行同源性比较并构建系统发生树,通过同源建模用chimera软件将2A氨基酸序列预测出蛋白空间结构模拟图,探讨二级、三级结构是否有差异。克隆2A基因并构建EV71 2A基因的重组表达质粒pIRES2-EGFP-2A。结果1.RD细胞的培养及病毒分离：成功培养RD细胞,无污染,接种后肠道病毒的致细胞病变(CPE)表现为：细胞圆缩、胞浆颗粒化、核固缩以及最后细胞破裂。2. RT-PCR鉴别诊断EV71：50份临床手足口病标本中有30份检测是EV71,其中轻型(手足口)13份,重型(手足口并发脑炎或心肌炎)17份。3.VPl、2A基因的扩增：5株轻症和5株重症的标本经EV71 VP1、2A基因特异性引物扩增,产物分别为1082 bp、539 bpo4.EV71病毒VP1、2A基因核苷酸序列测定与同源性比较、构建系统发生树：对扩增正确的10份PCR产物进行VP1基因和2A基因测序和遗传学分析,通过同源性比较和构建系统发生树发现,此10株EV71病毒和中国大陆已发表的5株EV71病毒(fuyangEU703814.1、xi anHM003207.1 shandongEU753418.1、shenzhenFJ607337.1、henanGU366191.1)全部属于C基因型,且核苷酸同源性较高,VP1基因和2A基因的同源性分别在94.7%-99.4%和93.6%-99.3%范围内。本次分离的10株EV71病毒与A、B基因型代表株比较,核苷酸同源性分别为81.0%-84.6%和78.4%-82.2%,差异较大。与已知的C1、C2、C3亚型代表株比较,核苷酸同源性在87.8%-90.2%,差异≥10%,与已知的C4亚型代表株比较,核苷酸同源性在96.8%-99.6%,因此认为可将这10株病毒划分为C4亚型。在系统发生树上,这10株病毒形成一个较独立的分支。5.2A蛋白空间结构模拟图：从重症57号和轻症20号的2A蛋白结构模拟图可以看出,57号有三个蛋白结构域与20号不同；其它4个重症(36、37、43、55号)和4个轻症(30、31、40、52号)患者病毒的2A蛋白结构也有一些不同,但没有发现轻、重症各自之间一致性的结构特征。6.2A基因克隆：经过PCR扩增和核酸测序证实,已成功获得2A基因。将空的T载体转入DH5a感受态细胞获得DH5a(T)。7.重组表达质粒pIRES2-EGFP-2A的构建：将轻、重型病例各一例分离的EV71的2A基因DNA插入pIRES2-EGFP,成功构建重组质粒pIRES2-EGFP-2A,通过PCR扩增、双酶切和核酸测序已证实。结论1.本次分离毒株均属于EV71 C基因亚型,且与中国大陆其他省区分离的毒株遗传关系紧密。2. EV71 VP1、2A基因分别在经测序的10个毒株之间遗传关系紧密且轻症和重症病例毒株之间均不存在差异。3.轻症、重症2A蛋白质二级、三级结构存在差异但未找到各自一致性的蛋白质结构特征。

全文目录

摘要  4-7
Abstract  7-14
1 前言  14-16
2 材料与方法  16-28
  2.1 实验材料  16-18
    2.1.1 毒株、细胞株  16
    2.1.2 培养基  16
    2.1.3 主要试剂及配方  16-17
    2.1.4 主要仪器及设备  17-18
  2.2 实验方法  18-28
    2.2.1 RD细胞的培养  18-20
    2.2.2 病毒分离  20-21
    2.2.3 提取病毒RNA,RT-PCR鉴别诊断EV71  21-22
    2.2.4 聚合酶链反应扩增EV71 VP1、2A基因  22-23
    2.2.5 VP1、2A基因核苷酸序列测定与同源性比较、构建系统发生树  23
    2.2.6 构建2A蛋白空间结构模拟图  23
    2.2.7 2A基因的克隆  23-26
    2.2.8 DH5α(T)的制备  26
    2.2.9 重组质粒pIRES2-EGFP-2A的构建  26-28
3 结果  28-37
  3.1 RD细胞的培养及病毒分离  28
  3.2 提取病毒RNA,RT-PCR鉴别诊断EV71  28
  3.3 VP1、2A基因的扩增  28-29
  3.4 VP1、2A基因核苷酸序列测定与同源性比较、构建系统发生树  29-34
  3.5 2A蛋白空间结构模拟图  34-35
  3.6 2A基因克隆  35-36
  3.7 重组表达质粒pIRES2-EGFP-2A的构建  36-37
4 讨论  37-42
  4.1 EV71的研究背景  37
  4.2 RT-PCR鉴别诊断EV71及VP1、2A基因的扩增  37-38
  4.3 VP1、2A基因核酸序列同源性、系统发生树分析  38-39
  4.4 2A蛋白空间结构模拟图  39-40
  4.5 2A基因克隆及重组表达质粒pIRES2-EGFP-2A的构建  40-42
5 结论  42-43
参考文献  43-45
综述肠道病毒71型的研究进展  45-62
  参考文献  57-62
附录  62-78
个人简历  78
硕士研究生期间发表论文  78-79
致谢  79

肠道病毒71型VP1基因及2A基因和蛋白质特征

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