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四肽Epithalon对HepG2细胞和L-02细胞端粒及端粒酶活性的影响

作　者: 童师亮
导　师: 王远亮
学　校: 重庆大学
专　业: 药物化学
关键词: Epithalon四肽肿瘤抑制 HepG2细胞 L-02细胞端粒端粒酶
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

目的:动物的一种内分泌腺——松果体,能分泌一种名为“Epithalamin”的缩氨酸,这种成分可被人工合成名叫“Epithalon”的四肽(Ala-Glu-Asp-Gly)。有报道Epithalon在动物体内具有一定的肿瘤抑制作用,本文的目的就是研究Epithalon作用于人肝癌细胞HepG2后,对HepG2细胞的生长情况、细胞端粒长度以及细胞端粒酶活性所产生的影响。同时,通过和Epithalon作用于人胎肝细胞L-02后细胞生长情况、端粒长度以及端粒酶活性的变化进行对比,研究Epithalon对细胞端粒和端粒酶的影响,探寻其可能的作用机制。方法:(1)采用Fmoc固相多肽合成法制备Epithalon四肽,高效液相层析(HPLC)纯化处理,运用NMR和质谱进行分析鉴定。(2)通过MTT法检测Epithalon四肽对人肝癌细胞株HepG2以及人胎肝细胞L-02增殖与活力的影响;用细胞形态学观察用药后细胞的生长情况,流式细胞仪检测细胞周期。(3)根据MTT检测结果,特定浓度用药一段时间后,运用端粒酶重复序列扩增-焦磷酸根酶联发光技术(TRAP-ELIDA)检测人肝癌细胞株HepG2和人胎肝细胞L-02端粒酶活性,流式荧光原位杂交法(FLOW-FISH)检测端粒长度。结果:(1)核磁与质谱结合分析鉴定表明,合成产物确为Epithalon四肽。(2)MTT法检测Epithalon四肽对人肝癌细胞株HepG2增殖与活力的影响显示:低浓度(0.00256～0.0256μmol/L)和高浓度(25.6μmol/L)的Epithalon对细胞生长影响不大,而0.256～2.56μmol/L的Epithalon对HepG2细胞有一定抑制作用。流式细胞仪检测细胞周期表明,Epithalon有一定的S期阻滞作用。Epithalon对人胎肝细胞株L-02增殖与活力的影响显示:2.56μmol/L～25.6μmol/L的Epithalon对L-02细胞增殖有促进作用。(3)运用TRAP-ELIDA检测人肝癌细胞株HepG2端粒酶活性,流式荧光原位杂交法(FLOW-FISH)检测端粒长度的变化,发现加入Epithalon后对HepG2细胞的端粒酶活性和端粒长度有一定的促进或延长作用,但这种作用并不明显。对L-02细胞而言,Epithalon能有效的提高细胞端粒酶活性,并使细胞端粒的长度得到延长。结论:研究显示特定浓度的Epithalon在体外对肿瘤细胞HepG2有一定的抑制作用,这种抑制作用可能主要表现为S期阻滞,其对HepG2细胞端粒酶和端粒长度也有一定的正向影响。与此同时,Epithalon和人胎肝细胞L-02的作用显示,Epithalon具有激活端粒酶,延长端粒、促进L-02细胞生长的作用。这提示我们,Epithalon能通过提高端粒酶活性来延长端粒,进而起到延长正常细胞乃至生物体寿命的作用。Epithalon还可能起到稳定染色体的作用,减少染色体因不稳定而引起的畸变等,进而减少这种畸变导致的癌症。衰老、癌症是多因素积累的结果,而Epithalon可能会是一种较安全的预防治疗性药物,就其抗肿瘤机制而言,Epithalon在体内可能主要是通过免疫调节途径发挥抗肿瘤作用,如果与其它抗肿瘤药物联用,有望提高抗肿瘤活性,降低毒副作用。

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-9
符号说明  9-10
1 绪论  10-19
  1.1 问题的提出及研究意义  10-11
    1.1.1 问题的提出  10
    1.1.2 课题的研究意义  10-11
  1.2 国内外研究现状  11-18
    1.2.1 端粒和端粒酶研究进展  11-14
    1.2.2 小分子多肽抗肿瘤研究进展  14-15
    1.2.3 四肽Epithalon 研究进展  15-18
  1.3 本文研究的目的和主要内容  18
    1.3.1 研究目的  18
    1.3.2 研究的主要内容  18
  1.4 实验技术路线  18-19
2 四肽 Epithalon 的制备和鉴定  19-31
  2.1 引言  19-20
  2.2 实验材料及设备  20
  2.3 Epithalon 的制备  20-24
    2.3.1 制备流程  20
    2.3.2 制备条件的选择  20-22
    2.3.3 实验操作过程  22-24
  2.4 Epithalon 的鉴定和纯化  24-29
    2.4.1 多肽纯化和鉴定的方法  24-25
    2.4.2 合成结果分析及鉴定  25-29
  2.5 本章小结  29-31
3 Epithalon 对肝癌细胞 HepG-2 和人胎肝细胞 L-02 端粒酶和端粒作用的研究  31-50
  3.1 引言  31
  3.2 材料和方法  31-34
    3.2.1 主要仪器  31-32
    3.2.2 主要试剂  32
    3.2.3 细胞株  32
    3.2.4 主要试剂的配制  32-33
    3.2.5 培养器皿及处理  33
    3.2.6 细胞的复苏、培养与传代  33-34
  3.3 实验方法  34-37
    3.3.1 MTT 法检测Epithalon 对细胞生长的影响  34
    3.3.2 HepG2 细胞和L-02 细胞形态学观察  34
    3.3.3 流式细胞仪检测Epithalon 对细胞周期的影响  34-35
    3.3.4 TRAP-ELIDA 法检测端粒酶活性  35-36
    3.3.5 FLOW-FISH 测定端粒长度  36-37
    3.3.6 统计学处理  37
  3.4 实验结果  37-46
    3.4.1 Epithalon 对细胞生长的影响  37-40
    3.4.2 细胞形态学观察  40-41
    3.4.3 流式细胞仪检测Epithalon 对细胞周期的影响  41-42
    3.4.4 Epithalon 对细胞端粒酶活性的影响  42-43
    3.4.5 细胞端粒长度的测定  43-46
  3.5 本章小结  46-50
4 研究结论及后续工作建议  50-56
  4.1 本课题研究的主要结论  52-54
  4.2 本文的主要创新之处  54
  4.3 后续工作及其展望  54-56
致谢  56-57
参考文献  57-61
附录 A 作者在攻读硕士学位期间发表的文章  61-62
附录 B 正文中无法列出的细胞图片  62-66

四肽Epithalon对HepG2细胞和L-02细胞端粒及端粒酶活性的影响

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