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抑制差减杂交分析嗜水气单胞菌可能的毒力基因及gneJ基因的克隆表达与活性分析

作　者: 龚霞
导　师: 姚火春
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 嗜水气单胞菌抑制性差减杂交(SSH) 可能的毒力基因分布检测 gneJ基因的克隆表达活性分析
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，Ah)是一类广泛存在于水环境的机会致病菌，它不仅能引发多种水生动物的传染病，而且也是爬行类、两栖类、鸟类等动物的重要病原菌。抑制性差减杂交(SSH)一种以抑制性PCR为基础的寻找差异表达基因的方法，是细菌基因组比较，病原体中未知基因的筛选乃至分子进化分析的重要研究手段。1．采用抑制差减杂交技术(Suppression subtractive hybridization，SSH)对嗜水气单胞菌强毒株J-1株与弱毒株MR-1株进行了基因组差异片段克隆与分析。共检出21个特异性差异片段，其中18个差异片段与气单胞菌及弧菌属基因有较高同源性，包括：黏附相关序列、调控序列、细胞分化序列、转录调节序列等，另外3个差异片段未发现有同源片段。结果表明，嗜水气单胞菌强毒株与弱毒株基因组间存在较多差异基因，为检测嗜水气单胞菌毒力株等奠定了良好的基础。2．通过Ah强毒株J-1、弱毒株MR-1之间的抑制性差减杂交(SSH)，选取其中4个可能与Ah毒力相关的片段，分别为与LPS生物合成及毒力作用有关的gne差向异构酶，调节毒力基因表达的BvgS因子，二硫化物结合蛋白异构酶DsbC，调理吞噬作用的FtsY基因。根据这4个片段的序列，设计了4对引物，用PCR方法对不同来源、不同毒力的22株嗜水气单胞菌进行了检测。结果表明，此4对引物中有3对可以有效地将致病株及无毒力株区分开来。此结果将有助于嗜水气单胞菌检测方法的建立．3．用PCR扩增了Ah J-1株完整的gneJ基因，将其克隆至质粒pET32a(+)，在大肠杆菌BL21中进行异源表达，SDS-PAGE结果显示重组表达蛋白的分子量约59.7kD，与理论推测值基本相同。酶活性分析表明该重组蛋白可将UDP-乙酰葡萄糖胺转化为UDP-乙酰半乳糖胺，确证gneJ基因编码蛋白为UDP-乙酰葡萄糖胺-4-差向异构酶。Western blot分析显示Ah J-1胞外产物的兔抗血清可识别该重组蛋白，表明该蛋白与天然蛋白有相同的抗原性，以重组蛋白为免疫原，对小鼠进行动物保护实验，显示该重组蛋白对小鼠有60％的保护率，证实了UDP-乙酰葡萄糖胺-4差向异构酶与水生动物源性嗜水气单胞菌的毒力作用有关。

全文目录

中文摘要  6-7
英文摘要  7-9
第一篇文献综述  9-25
  第一章细菌毒力因子鉴定技术的研究进展  9-16
    1 生物化学方法  9
    2 常见遗传学方法  9-11
    3 寻找差异表达基因的方法  11-14
    参考文献  14-16
  第二章抑制性差减杂交技术及其应用概况  16-25
    1 抑制性差减杂交(SSH)技术简介  16
    2 抑制差减杂交技术的分子基础  16-18
    3 SSH的技术要点  18-20
    4 SSH技术的应用  20-22
    参考文献  22-25
第二篇试验研究  25-69
  第三章嗜水气单胞菌可能的毒力基因片段的发现  25-46
    1 材料与方法  26-34
    2 结果  34-39
    3 讨论  39-42
    参考文献  42-46
  第四章嗜水气单胞菌可能的毒力基因的分布  46-54
    1 材料与方法  46-47
    2 结果  47-49
    3 讨论  49-51
    参考文献  51-54
  第五章嗜水气单胞菌 UDP-乙酰葡萄糖胺-4-差向异构酶基因的克隆表达、活性检测与免疫性研究  54-69
    1材料  55
    2方法  55-61
    2 结果  61-65
    3 讨论  65-66
    参考文献  66-69
全文总结  69-70
致谢  70

抑制差减杂交分析嗜水气单胞菌可能的毒力基因及gneJ基因的克隆表达与活性分析

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