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聚乙二醇化尿酸酶的制备、纯化及性质研究

作　者: 张锐
导　师: 孟延发
学　校: 四川大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 尿酸酶聚乙二醇修饰 PEG2-NHS
分类号: Q814.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

尿酸酶分解嘌呤代谢最终产物尿酸，生成水溶性更强，更易分解的尿囊素。当尿酸在血液中沉积，引起肾衰竭以及痛风等疾病。尿酸酶针对禁忌常规治疗和常规疗法无效的患者，能快速降低血液中尿酸盐的含量。但作为外源蛋白有较高抗原性，影响了尿酸酶的活性。需要在尿酸酶分子表面结合一种水溶性高聚物，从而降低尿酸酶的抗原性，延长它在体内的半衰期。蛋白质PEG修饰技术在过去的20年中得到了快速发展，已有多篇文献报道了经PEG修饰的蛋白质药物降低了免疫原性、提高了稳定性、延长了半衰期，并用于临床治疗各种疾病。本文研究尿酸酶聚乙二醇修饰的条件、纯化方法以及修饰产物生物学活性和酶动力学性质的改变。通过对温度、pH、尿酸酶浓度、PEG和尿酸酶质量比等条件的筛选，确定pH8.5，4℃，尿酸酶与PEG₂-NHS质量比1：10，尿酸酶浓度2mg／mL为最佳修饰条件，10min内反应完全。凝胶过滤层析测定尿酸酶分子量为70kD，结合还原和非还原性SDS-PAGE判断尿酸酶由两条分子量30kD的亚基通过二硫键组合而成。制备型PAGE电泳分离纯化后，尿酸酶和PEG-尿酸酶通过SDS-PAGE电泳检测均为单一条带。收集凝胶，回收反应混合液总活性的46.7％，目标产物130kD的PEG-尿酸酶占12％。尿酸酶最适温度和pH分别为40℃、pH8.5，经PEG修饰后，最适温度和pH变为35℃、pH8.0。修饰前后的尿酸酶在pH7.5-9.0范围内，温度40℃以下都比较稳定，PEG-尿酸酶在各个pH范围内都比尿酸酶相对稳定，修饰后尿酸酶的热稳定性也有所提高。在最适条件下，测定尿酸酶和PEG-尿酸酶Km分别为16.62×10^-5mol／L、17.8×10^-5mol／L。测定了尿酸酶和PEG-尿酸酶Km随pH、温度改变的变化情况，Km均高于最适条件得出的结果。采用TNBS法测定尿酸酶的氨基修饰率为16.7％。修饰后的PEG-尿酸酶抗胰蛋白酶水解能力明显高于未修饰的尿酸酶，在胰蛋白酶作用40min后仍保留原活性的20％，而尿酸酶在胰蛋白酶作用30min后活性就完全丧失。

全文目录

中文摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
引言  9-11
第一部分综述  11-31
  1 蛋白质的化学修饰  11-16
    1.1 原理和意义  11-12
    1.2 蛋白质化学修饰方法  12-13
      1.2.1 蛋白质的性质  12
      1.2.2 修饰剂的选择  12-13
      1.2.3 反应条件的选择  13
    1.3 化学修饰对蛋白质性质的影响  13-16
      1.3.1 保护活性部位和抗抑制剂  13-14
      1.3.2 增强稳定性和耐热性  14-15
      1.3.3 维持完整性与抗蛋白水解酶  15
      1.3.4 消除抗原性和稳定微环境  15-16
    1.4 蛋白质化学修饰的展望  16
  2 聚乙二醇偶联  16-25
    2.1 PEG修饰的原理与方法  16-21
      2.1.1 氨基的修饰  17-19
      2.1.2 半胱氨酸(巯基)的修饰  19-20
      2.1.3 氧化的糖或N端的修饰  20-21
    2.2 修饰过程  21
      2.2.1 液相反应  21
      2.2.2 固相反应  21
    2.3 反应产物的鉴定和检测  21-23
      2.3.1 蛋白质或多肽的平均修饰度  21
      2.3.2 修饰位点和位置异构体的检测  21-22
      2.3.3 偶合物的均一性  22-23
    2.4 PEG修饰蛋白药物的开发与临床应用状况  23-25
  3 尿酸酶介绍  25-31
    3.1 尿酸酶概述  25-27
    3.2 尿酸酶的反应机制  27-28
    3.3 尿酸酶与嘌呤代谢  28
    3.4 灵长动物中尿酸酶分子进化  28-29
    3.5 尿酸酶在临床检测和治疗上的应用  29-31
      3.5.1 尿酸酶在临床检测上的应用  29-30
      3.5.2 尿酸酶在临床治疗上的应用  30-31
第二部分实验  31-66
  第一章 PEG修饰尿酸酶反应的条件优化  31-46
    1.1 试剂和仪器  31-32
      1.1.1 实验材料  31
      1.1.2 仪器设备  31
      1.1.3 主要试剂  31-32
    1.2 实验方法  32-41
      1.2.1 蛋白浓度测定  32-34
      1.2.2 SDS-PAGE  34-35
      1.2.3 PAGE电泳  35-36
      1.2.4 分子筛电泳  36-37
      1.2.5 尿酸酶分子量和结构分析  37-38
      1.2.6 聚丙烯酰胺凝胶的碘染色  38-39
      1.2.7 尿酸酶PEG修饰反应进程分析  39
      1.2.8 尿酸酶浓度对修饰反应的影响  39
      1.2.9 尿酸酶和PEG质量比对修饰反应的影响  39-40
      1.2.10 温度对修饰反应的影响  40
      1.2.11 pH对修饰反应的影响  40-41
    1.3 实验结果  41-45
      1.3.1 尿酸酶分子量和结构分析  41-42
      1.3.2 尿酸酶PEG修饰反应进程分析  42-43
      1.3.3 尿酸酶浓度对修饰反应的影响  43-44
      1.3.4 尿酸酶和PEG质量比对修饰反应的影响  44
      1.3.5 温度对修饰反应的影响  44
      1.3.6 pH对修饰反应的影响  44-45
    1.4 本章小结  45-46
  第二章 PEG化尿酸酶的分离纯化  46-55
    2.1 材料和仪器  46-47
      2.1.1 实验材料  46
      2.1.2 仪器设备  46
      2.1.3 主要试剂  46-47
    2.2 实验方法  47-50
      2.2.1 尿酸酶活性测定方案  47-49
      2.2.2 蛋白含量的测定  49
      2.2.3 制备电泳分离纯化PEG-尿酸酶  49-50
      2.2.4 凝胶过滤层析测定尿酸酶及PEG-尿酸酶分子量  50
    2.3 结果与讨论  50-54
      2.3.1 制备电泳  51-52
      2.3.2 Sephacryl S200凝胶过滤层析测定尿酸酶分子量  52-53
      2.3.3 DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析  53-54
    2.4 本章小结  54-55
  第三章 PEG化尿酸酶的性质研究  55-66
    3.1 材料和仪器  55-56
      3.1.1 实验材料  55
      3.1.2 仪器设备  55
      3.1.3 主要试剂  55-56
    3.2 实验方法  56-60
      3.2.1 酶活力的测定方案  56
      3.2.2 pH对尿酸酶活性影响的研究  56-57
      3.2.3 温度对尿酸酶活性影响的研究  57-58
      3.2.4 米氏常数(K_m)的测定  58-59
      3.2.5 TNBS法测定尿酸酶修饰度  59-60
      3.2.6 抗胰蛋白酶水解能力分析  60
    3.3 结果与讨论  60-64
      3.3.1 pH对尿酸酶及PEG化尿酸酶活性的影响  60-61
      3.3.2 温度对尿酸酶及PEG化尿酸酶活性影响  61-62
      3.3.3 米氏常数(K_m)的测定  62-63
      3.3.4 TNBS法测定尿酸酶氨基修饰度  63-64
      3.3.5 抗胰蛋白酶水解能力分析  64
    3.4 本章小结  64-66
参考文献  66-71
致谢  71-72
在读期间所发表文章目录  72-73

聚乙二醇化尿酸酶的制备、纯化及性质研究

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