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聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素的研究

作　者: 翟宁
导　师: 冯军；赵文杰
学　校: 上海医药工业研究院
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 神经毒素镇痛药聚乙二醇修饰
分类号: TQ464
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

聚乙二醇(PEG)修饰蛋白质技术已成功用于改善多种蛋白质药物的性能。为了解决眼镜蛇神经毒素(CNT)临床应用时起效慢、镇痛效果不太显著的问题，本课题将PEG修饰技术应用于CNT。用简单的两步层析法——Source 30S阳离子交换和Superdex 75凝胶过滤，自眼镜蛇毒粗品中分离纯化出了CNT。SDS-PAGE检测其为单一条带，RP-HPLC检测纯度达100％。总的纯化收率为22.4％，比文献报道的12％得到了提高。针对纯化的CNT，采用了四种活化mPEG试剂——mPEG-SPA、mPEG-SMB、mPEG-ButyrALD和mPEG2-NHS修饰氨基。以获得最高比例的单修饰产物为目标，优化修饰反应条件。最终确定mPEG-SPA 5K为最适宜的修饰剂；优选的反应条件是pH8.0，CNT／mPEG(摩尔比)为1∶5，反应时间1h，温度28℃，其中反应摩尔比的影响最显著，而pH的影响最微弱。修饰产物用Source 30S阳离子交换层析法分离纯化。对修饰产物进行了分子量、稳定性、免疫原性及药效的测定，并对修饰位点做了初步研究。该产物经SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS法检测为单修饰。与天然CNT相比，其反复冻融稳定性和热稳定性得到提高；免疫原性和毒性大为降低；在同样剂量下和相同时间点的镇痛活性也得到增强。以上性质显示出了PEG修饰的优越性。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-8
缩写  8-9
第1章文献综述  9-28
  1．1 镇痛药物——眼睛蛇神经毒素  9-13
    1．1．1 疼痛与镇痛药物  9-10
      1．1．1．1 疼痛的危害和神经学机理  9
      1．1．1．2 镇痛药物  9-10
    1．1．2 眼镜蛇神经毒素  10-13
      1．1．2．1 来源及分类  10
      1．1．2．2 理化性质  10
      1．1．2．3 分子结构  10-11
      1．1．2．4 镇痛机理  11-12
      1．1．2．5 分离纯化  12-13
      1．1．2．6 临床应用  13
  1．2 蛋白质药物的PEG修饰  13-25
    1．2．1 PEG修饰蛋白质技术在生物医药领域的应用  14-15
    1．2．2 PEG的结构与基本生物学性质  15
    1．2．3 PEG修饰反应的类型  15-19
      1．2．3．1 氨基的修饰  15-17
      1．2．3．2 半胱氨酸(巯基)的修饰  17-18
      1．2．3．3 氧化的糖或N端的修饰  18-19
    1．2．4 PEG修饰反应的过程  19
      1．2．4．1 液相反应  19
      1．2．4．2 固相反应  19
    1．2．5 PEG修饰蛋白质的反应方案设计  19-21
      1．2．5．1 选择合适的活化PEG  20
      1．2．5．2 修饰反应条件的优化  20-21
    1．2．6 PEG化蛋白质的分析与分离方法  21-25
      1．2．6．1 PEG修饰蛋白质的分析方法  21-23
      1．2．6．2 PEG修饰蛋白质的分离纯化方法  23-25
  1．3 本课题的研究目的和内容  25-28
    1．3．1 研究目的  25-26
    1．3．2 研究内容  26-28
      1．3．2．1 CNT的分离纯化  26
      1．3．2．2 PEG修饰CNT  26-27
      1．3．2．3 CNT修饰产物性质的测定  27-28
第2章眼镜蛇神经毒素的分离纯化  28-41
  2．1 引言  28
  2．2 材料与仪器  28-29
    2．2．1 主要材料与试剂  28
    2．2．2 主要仪器和设备  28-29
  2．3 实验方法  29-34
    2．3．1 CNT的纯化路线  29
    2．3．2 CNT的纯化方法  29-30
      2．3．2．1 离子交换层析(IEC)  29-30
      2．3．2．2 凝胶过滤层析(GFC)  30
    2．3．3 CNT纯度的检测方法  30-33
      2．3．3．1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)  30-32
      2．3．3．2 反向高效液相(RP-HPLC)  32-33
    2．3．4 蛋白质浓度的检测方法  33-34
  2．4 实验结果  34-39
    2．4．1 眼镜蛇毒粗品的组成  34
    2．4．2 阳离子交换层析(1EC)  34-36
    2．4．3 凝胶过滤层析(GFC)  36-38
    2．4．4 纯化步骤的得率  38-39
  2．5 小结  39
  2．6 讨论  39-41
第3章 MPEG对眼镜蛇神经毒素的修饰及产物的纯化  41-60
  3．1 引言  41
  3．2 材料与仪器  41
    3．2．1 主要材料与试剂  41
    3．2．2 主要仪器与设备  41
    3．2．3 实验动物  41
  3．3 实验方法  41-44
    3．3．1 修饰反应及分离纯化流程  41-42
    3．3．2 修饰反应  42-43
      3．3．2．1 与mPEG-SPA 5K的反应  42-43
      3．3．2．2 与mPEG-ButyrALD 5K的反应  43
    3．3．3 RP-HPLC检测修饰产物组成  43
    3．3．4 阳离子交换层析法分离修饰产物  43-44
    3．3．5 修饰产物纯度检测  44
    3．3．6 修饰产物的药效研究  44
    3．3．7 正交试验  44
  3．4 实验结果  44-57
    3．4．1 pH和反应摩尔比的预优化  44-48
      3．4．1．1 与mPEG-SPA5K的反应  44-48
    3．4．2 修饰产物的分离纯化  48-50
      3．4．2．1 mPEG-SPA修饰  49
      3．4．2．2 mPEG-SMB 5K修饰  49-50
      3．4．2．3 mPEG-ButyrALD 5K修饰  50
    3．4．3 修饰产物的纯度测定及性质比较  50-55
    3．4．4 修饰产物的药效比较  55-56
    3．4．5 正交试验  56-57
  3．5 小结  57-58
  3．6 讨论  58-60
第4章修饰产物性质的研究  60-72
  4．1 引言  60
  4．2 材料与仪器  60
    4．2．1 主要材料与试剂  60
    4．2．2 主要仪器与设备  60
    4．2．3 实验动物  60
  4．3 实验方法  60-63
    4．3．1 Superdex 75 H 10／30柱检测  60-61
    4．3．2 毛细管区带电泳法检测  61
    4．3．3 质谱测定分子量  61
    4．3．4 修饰位点的确定  61-62
      4．3．4．1 N-端测序  61
      4．3．4．2 肽图比较  61-62
    4．3．5 稳定性试验  62
      4．3．5．1 反复冻融稳定性  62
      4．3．5．2 热稳定性  62
    4．3．6 免疫原性试验  62-63
      4．3．6．1 试剂配制  62
      4．3．6．2 操作过程  62-63
    4．3．7 药效试验  63
      4．3．7．1 急性毒性(LD_(50))  63
      4．3．7．2 镇痛效果  63
  4．4 实验结果  63-70
    4．4．1 Superdex 75 H 10／30柱检测  63-64
    4．4．2 毛细管电泳法检测  64
    4．4．3 质谱测定的分子量  64-66
    4．4．4 修饰位点的确定  66
      4．4．4．1 N-端序列  66
      4．4．4．2 肽图比较结果  66
    4．4．5 稳定性  66-68
      4．4．5．1 反复冻融稳定性  66-67
      4．4．5．2 热稳定性  67-68
    4．4．6 免疫原性  68
    4．4．7 药效  68-70
      4．4．7．1 急性毒性(LD_(50))  69
      4．4．7．2 镇痛效果  69-70
  4．5 小结  70
  4．6 讨论  70-72
总结与展望  72-74
参考文献  74-80
学位论文研究工作期间发表的文章及专利  80-81
致谢  81-82
附录  82-86

聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素的研究

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