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SPC-A1细胞应答呼吸道合胞病毒感染的敏感基因zlg10的克隆、表达及功能探讨

作　者: 李蕾
导　师: 张楚瑜
学　校: 武汉大学
专　业: 微生物学
关键词: SPC-A1细胞呼吸道合胞病毒(RSV) mRNA差异显示法 GST融合蛋白多克隆抗血清
分类号: R373
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是引起婴幼儿严重下呼吸道感染的重要病毒性病原体。该病毒流行广泛,致病率高,多数儿童两岁前都感染过RSV,在老年人和免疫力低下的人群中也会暴发流行。RSV属副黏病毒科,肺炎病毒属,病毒粒子直径约150～300nm。RSV的基因组为单股负链RNA,长约15kb,编码11种蛋白质,包括3种核衣壳蛋白(核壳蛋白N、磷酸蛋白P、大聚合酶蛋白L);3种跨膜蛋白(融合蛋白F、附着蛋白G、小疏水蛋白SH);2种基质蛋白(M、M2)和2种非结构蛋白(NS1、NS2)。RSV感染的临床症状在不同年龄组往往不同,一般可致鼻炎、中耳炎、哮喘、支气管炎、细支气管炎和肺炎,尤其以后两种疾病最为严重,甚至可导致死亡。目前能有效治疗RSV感染的药物很少,且疗效不确定。世界卫生组织(WHO)已将研制RSV疫苗列为全球疫苗计划的优先发展项目之一。但迄今为止,尚无安全、有效的RSV疫苗获准上市。分子生物学研究已经证实当病毒感染宿主细胞时,宿主细胞会发生变化,其中有一些特异性的序列表达量有所改变。mRNA差异显示法(mRNA differential display,DDRT-PCR)是目前筛选差异表达基因最有效的方法之一。为了筛查到与病毒感染相关的宿主细胞敏感基因,本研究以呼吸道合胞病毒RSV感染的SPC-A1细胞与正常SPC-A1细胞为样本,通过mRNA差异显示技术获得了SPC-A1细胞应答RSV感染的mRNA差异表达谱,并且克隆到了50余个与呼吸道合胞病毒RSV致病相关的EST片段。随后选择在RSV感染后的SPC-A1细胞中高表达的EST片段g10-1为研究对象,经克隆测序g10-1长264bp,采用生物信息学方法对g10-1进行了鉴定后证实这是一个新基因片段,随后电子克隆获得的g10-1的延伸产物为761bp,含有一个编码54个氨基酸的读码框,命名为zlg10基因。zlg10编码的蛋白质与己知蛋白质均无显著同源性,亚细胞定位实验证实是一个新的核蛋白质。Northern Blot杂交分析验证后,设计了zlg10含完整阅读框的特异性扩增引物,通过RT—PCR方法克隆出了该基因。为了了解新基因zlg10在RSV感染细胞过程中如何被调节以及在RSV感染过

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-13
第一章呼吸道合胞病毒的生物学特性及其治疗和预防  13-26
  1.1 前言  13
  1.2 RSV的生物学和分子生物学  13-15
  1.3 RSV的流行病学  15-17
  1.4 RSV感染的免疫应答及发病机理  17-21
    1.4.1 T、B淋巴细胞  18
    1.4.2 CD_4~+和CD_8~+T淋巴细胞亚群及其细胞因子  18-19
    1.4.3 嗜酸性粒细胞(EOS)及嗜酸性粒细胞阳离子蛋白  19-20
    1.4.4 趋化因子  20
    1.4.5 黏附分子  20-21
    1.4.6 IgE、IgG4抗体和其它  21
  1.5 病毒感染治疗和预防  21-26
    1.5.1 RSV感染的传统治疗方法  21-22
    1.5.2 RSV感染的基因治疗  22-26
第二章筛选差异表达基因的方法及应用  26-36
  2.1 前言  26
  2.2 筛选差异表达基因的方法  26-32
    2.2.1 mRNA差异展示技术  26-28
    2.2.2 消减杂交技术  28-31
    2.2.3 RNA任意引物PCR  31-32
  2.3 从EST出发快速鉴定新的差异表达基因  32-35
    2.3.1 发现表达基因的新战略  32-33
    2.3.2 利用EST电子杂交基因克隆  33-34
    2.3.3 EST应用中应注意解决的问题  34-35
  2.4 展望  35-36
第三章 SPC-A1细胞应答RSV感染的mRNA差异显示谱的研究  36-46
  3.1 前言  36
  3.2 材料与方法  36-40
    3.2.1 试剂  36
    3.2.2 溶液配制  36-37
    3.2.3 细胞培养与病毒感染  37-38
    3.2.4 细胞总RNA提取  38-39
    3.2.5 cDNA第一链合成  39
    3.2.6 PCR反应  39
    3.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和银染  39-40
    3.2.8 二次PCR扩增和差异显示带回收  40
    3.2.9 T-A克隆与测序  40
  3.3 结果  40-42
    3.3.1 细胞病变与RNA提取  40-41
    3.3.2 PCR扩增条件优化  41
    3.3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染  41-42
    3.3.4 克隆、测序和相似性检索  42
  3.4 讨论  42-46
    3.4.1 RNA的提取和反转录  43-44
    3.4.2 差异显示方法改进  44
    3.4.3 差异表达基因与功能分析  44-46
第四章 SPC-A1细胞应答RSV感染的敏感基因zlg10的克隆及其编码蛋白亚细胞定位的研究  46-61
  4.1 材料与方法  46-52
    4.1.1 毒株和细胞  46
    4.1.2 酶及试剂  46-47
    4.1.3 溶液配制及处理  47
    4.1.4 电子克隆的基本原理及步骤  47
    4.1.5 含完整编码区的cDNA的克隆及验证  47-50
    4.1.6 Northern Blot杂交分析  50
    4.1.7 EGFP融合蛋白表达载体的构建及转染  50-52
  4.2 结果  52-59
    4.2.1 新基因片段g10-1的克隆及测序  52-53
    4.2.2 新基因片段g10-1的鉴定  53
    4.2.3 电子延伸结果、开放阅读框架及序列特征  53-55
    4.2.4 蛋白质的特点及功能区的分析  55
    4.2.5 zlg10的疏水性分析  55-56
    4.2.6 zlg10跨膜区的分析  56
    4.2.7 Northem Blot杂交分析  56-57
    4.2.8 含完整编码区的cDNA的克隆及验证  57-58
    4.2.9 细胞内EGFP融合蛋白的观察及定位  58-59
  4.3 讨论  59-61
第五章 SPC-A1细胞应答RSV感染的敏感蛋白ZLG10的表达与纯化  61-75
  5.1 材料与方法  61-67
    5.1.1 毒株和细胞  61
    5.1.2 质粒和菌株  61
    5.1.3 工具酶、试剂和试剂盒  61-62
    5.1.4 SDS-PAGE所用试剂与溶液  62-63
    5.1.5 亲和层析及蛋白纯化相关试剂  63-64
    5.1.6 引物设计与合成  64
    5.1.7 重组表达载体pGEX-4T-zlg10的构建  64-65
    5.1.8 GST-ZLG10融合蛋白的原核表达电泳样品制备  65
    5.1.9 表达产物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳  65-66
    5.1.10 GSH亲和层析纯化GST-ZLG10融合蛋白  66-67
  5.2 结果  67-72
    5.2.1 zlg10基因的逆转录PCR扩增及鉴定  67
    5.2.2 原核表达载体pGEX-4T-zlg10的构建及酶切鉴定  67-69
    5.2.3 GST-ZLG10融合蛋白的表达和纯化  69-72
  5.3 讨论  72-75
第六章 ZLG10特异性抗血清的制备及其功能研究  75-85
  6.1 材料和方法  75-78
    6.1.1 材料  75
    6.1.2 溶液配制  75-76
    6.1.3 兔抗GST-ZLG10融合蛋白多克隆抗血清的制备和纯化  76
    6.1.4 ELISA法测定兔抗GST-ZLG10抗体的滴度  76
    6.1.5 Western blot分析兔抗GST-ZLG10抗体的特异性  76-77
    6.1.6 不同方式下ZLG10抗血清对病毒感染的抑制情况  77-78
  6.2 结果  78-84
    6.2.1 兔抗GST-ZLG10多克隆抗血清的制备和纯化  78
    6.2.2 兔抗ZLG10多克隆抗血清抑制RSV感染的效果  78-84
  6.3 讨论  84-85
研究总结  85-86
参考文献  86-103
在读期间发表的文章  103-104
致谢  104-105

SPC-A1细胞应答呼吸道合胞病毒感染的敏感基因zlg10的克隆、表达及功能探讨

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