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耐辐射菌PprI蛋白的制备及其对小鼠急性辐射损伤作用的研究

作　者: 张永芹
导　师: 杨占山
学　校: 苏州大学
专　业: 放射医学
关键词: 耐辐射球菌 PprI蛋白原核表达急性辐射损伤
分类号: R818
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)(简称DR)是一种对电离辐射,紫外线,强氧化剂和化学诱变剂具有超强耐受力的极端微生物,是迄今为止地球上发现的抗辐射能力最强的生物之一。最近研究表明,负责这一抗性的开关基因—pprI基因在DNA损伤修复中起着极为重要的作用。pprI基因可作为一个保护开关基因诱导DNA修复基因如recA和pprA的表达,在提高细胞抗氧化能力方面,也可能通过调控过氧化氢酶的表达活性来提高抗H2O2的能力。我们近年的研究表明,pprI基因转染对哺乳动物中子和γ射线急性放射损伤具有显著的防治作用。然而,基因转染用于放射损伤的防治存在一定的困难和局限性。因此,本课题进一步研究pprI基因原核表达系统的构建、PprI蛋白的表达及其纯化,并将其注入受照小鼠体内,研究PprI蛋白对小鼠γ射线急性放射损伤的防治作用。耐辐射球菌pprI基因表达的PprI原核蛋白对真核生物的抗放作用,迄今尚未见国内外文献报道。材料与方法:以我们已获得国家发明专利的pCMV-HA-pprI质粒为模板,构建重组原核表达质粒pET-28a-His-pprI,并转化入E. coli BL21(DE3)RP。IPTG诱导融合蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。然后采用His-Bind树脂和分子筛两步法进行蛋白纯化,获得纯化的耐辐射球菌PprI融合蛋白。将PprI融合蛋白注射入ICR小鼠体内,并对PprI蛋白注射组与生理盐水注射组分别用γ射线进行照射,观察急性放射损伤小鼠的血细胞数目和淋巴细胞百分比,应用流式细胞仪检测骨髓细胞、胸腺及脾脏淋巴细胞的凋亡率,采用CCK8检测骨髓细胞、胸腺及脾脏淋巴细胞的增殖率,以期探讨PprI蛋白对γ射线辐射损伤小鼠的抗放作用。结果:本课题成功构建了pET-28a-His-pprI原核表达载体,SDS-PAGE和Western blot证实表达产物确为6×His-PprI融合蛋白,相对分子质量约为37KD。纯化后获得了耐辐射球菌PprI融合蛋白。PprI蛋白于小鼠γ射线照射前1天、照射当天和照射后3天以100μg/kg的剂量肌肉注射入小鼠体内。在小鼠照后28天的观察期间内,由外周血象观察可见,PprI蛋白注射组小鼠外周血血小板总数在照后第7天为482.75×109/L,显著高于生理盐水注射组小鼠(P<0.05);外周血淋巴细胞百分比在照后第1天为41.00%,第7天为47.25%,均显著高于生理盐水注射组小鼠(P<0.05);由细胞凋亡检测可见,PprI蛋白注射组脾细胞凋亡率在第1天为13.43%,第14天为24.85%,均显著低于生理盐水注射组小鼠(P<0.05);胸腺细胞凋亡率在第14天为8.86%,第28天为6.21%,均显著低于生理盐水注射组小鼠(P<0.05);骨髓细胞凋亡率在第1天为10.70%,第14天为18.74%,第28天为5.31%,均显著低于生理盐水注射组小鼠(P<0.05);由细胞增殖检测可见,PprI蛋白注射组脾细胞A450值在第14天为0.647,第28天为1.827,均显著高于生理盐水注射组小鼠(P<0.05);胸腺细胞A450值在第7天为0.340,显著高于生理盐水注射组小鼠(P<0.05);骨髓细胞A450值在第14天为0.539,显著高于生理盐水注射组小鼠(P<0.05)。结论:1.成功构建了耐辐射菌pprI基因的原核表达质粒pET-28a-His-pprI,并在E. coli中有效表达PprI融合蛋白,经纯化定量获得较大量蛋白质。2.初步探索出较合适的PprI蛋白剂量及给药方法:100μg/kg,肌肉注射。3. PprI蛋白注射可显著减轻γ射线急性损伤小鼠血小板和淋巴细胞的下降程度。4. PprI蛋白注射可显著降低γ射线急性损伤小鼠骨髓细胞、胸腺和脾脏淋巴细胞的凋亡率。5. PprI蛋白注射可显著提高γ射线急性损伤小鼠骨髓细胞、胸腺和脾脏淋巴细胞的增殖率。6.本文研究结果提示,PprI原核蛋白注射对哺乳动物急性放射损伤具有较好的防治作用,为进一步用于各种核突发事件大剂量电离辐射引起的急性辐射损伤的防治提供了有价值的实验资料。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-10
前言  10-14
第一部分抗辐射球菌 PprI 蛋白的原核表达及纯化  14-27
  材料与方法  14-21
  实验结果  21-24
  讨论  24-26
  小结  26-27
第二部分耐辐射球菌PprI 蛋白防治小鼠放射损伤的注射剂量及给药方法的研究  27-41
  材料与方法  27-28
  实验结果  28-38
  讨论  38-40
  小结  40-41
第三部分抗辐射球菌 PprI 蛋白对急性放射损伤小鼠血象和细胞凋亡作用的研究  41-59
  材料与方法  41-42
  实验结果  42-56
  讨论  56-58
  小结  58-59
第四部分抗辐射球菌 PprI 蛋白对急性放射损伤小鼠细胞增殖作用的研究  59-67
  材料与方法  59-60
  实验结果  60-64
  讨论  64-66
  小结  66-67
结论  67-68
参考文献  68-73
综述  73-80
   参考文献  78-80
研究生期间发表论文  80-81
附录  81-88
致谢  88-89

耐辐射菌PprI蛋白的制备及其对小鼠急性辐射损伤作用的研究

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