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乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子ⅠDNA结合蛋白的筛选及SBP1的功能研究　

作　者: 洪源
导　师: 成军
学　校: 中国人民解放军军医进修学院
专　业: 内科学
关键词: DNA结合蛋白基因启动子肝炎病毒表面抗原功能研究乙型核心序列未知功能转录调控全长编码序列
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
下　载: 65次
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内容摘要

乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒，据统计，全世界HBsAg的携带者可达两亿人。在我国，它是导致肝炎、肝硬化、肝癌的主要原因。然而，到目前为止，HBV的某些遗传特性及转录调控的分子生物学机制尚不十分清楚。该病毒的顺式作用元件包含四个启动子(CP、XP、SPI、SPⅡ)、两个增强子(EnhⅠ和EnhⅡ)和糖皮质激素应答元件，负责调控病毒的复制及病毒蛋白的转录、表达。其中，SPI负责2.4kb mRNA的转录，编码表面抗原大蛋白。目前的研究认为表面抗原大蛋白的表达具有肝特异性，在HBV的嗜肝性及复制循环中扮演着重要角色。为了进一步了解SPI的转录调节作用，寻找新的未知功能的肝特异性转录蛋白，我们应用九十年代初出现的酵母单杂交技术，对人肝细胞文库进行了筛选，以期筛选出能与SPI结合的蛋白基因。根据HBV ayw全基因组序列，我们设计了HBV-SPI的3重复核心序列为“诱饵”，连接到pHISi、pHISi-1和pLacZi载体中，经酶切及测序证实后，将线性化的载体转化酵母菌株YM4271，并整合于其基因组上，得到报告菌株YMSP1-HIS和YMSP1-LacZ。将人肝文库质粒转化入YMSP1-HIS报告菌株，铺板于含30 mmol／L 3-AT的SD／-Leu／-His(亮氨酸和组氨酸)缺陷平板上。提取直径＞2mm的阳性克隆质粒，经酶切鉴定后转化入YMSP1-LacZ报告菌株，铺板于SD／-Ura／-Leu (尿嘧啶和亮氨酸)缺陷平板上，以克隆提取滤膜反应验证是否有激活酵母报告株β-半乳糖苷酶(β-gal)的活性。对双阳性质粒进行测序，根据测序结果，对其中的已知基因和一个新基因进行了生物信息学分析。将这一未知功能的蛋白命名为 SBP，设计引物，从人肝癌细胞基因组中得到了 SBP基因的全长编码序列，连接到真核表达载体 pCDNA3．l厂冲，与 SP的氯霉素乙酚转移酶（CAT）报告载体pCAT3七P共转染人肝癌细胞系HcyGZ，发现SBPI的表达可使SPI的转录活性下降，说明 SBP有抑制 HBV表面抗原大蛋白表达的功能。此外，我们还应用基因芯片技术研究了 SBP对肝细胞基因表达谱的影响。对 SP核心序列特异结合的蛋白的筛选，为今后更好地了解HBV的转录调控机制及生活史提供了线索。特别是SBPI有抑制HBV表面抗原大蛋白表达的功能，这可能意味着一条新的抗乙肝病毒治疗途径的发现。

全文目录

中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
主要仪器设备  9-11
英文缩略词  11-13
前言  13-14
第一部分 HBV-SPⅠ的酵母单杂交“饵”载体的构建及鉴定  14-26
  引言  15
  第一节 HBV-SPⅠ的酵母单杂交“饵”载体的构建  15-18
  第二节 HBV-SPⅠ的酵母单杂交“饵”载体的鉴定  18-23
  讨论  23-26
第二部分酵母单杂交筛选  26-39
  引言  27
  第一节酵母单杂交缺陷性报告株的构建  27-31
  第二节酵母单杂交系统筛选与HBV表面抗原基因启动子Ⅰ（SPⅠ）结合的蛋白基因  31-36
  讨论  36-39
第三部分 SBP1克隆化及功能学研究  39-53
  引言  40
  第一节 HBV表面抗原基因启动子Ⅰ结合蛋白1（SBP1）的克隆化  40-44
  第二节 SBP1表达载体与HBV-SPⅠ报告载体共转染真核细胞  44-47
  第三节 SBP1反式调节基因的表达谱芯片实验  47-50
  讨论  50-53
总结  53-54
文献综述  54-66
  文献综述一  54-61
  文献综述二  61-66
攻读硕士学位期间发表的文章  66-67
致谢  67

乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子ⅠDNA结合蛋白的筛选及SBP1的功能研究

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