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利用同源序列法克隆柑橘抗病基因类似物及其初步分析

作　者: 谌谋华
导　师: 邓秀新
学　校: 华中农业大学
专　业: 果树学
关键词: 柑橘抗病基因抗病基因同源类似物 RFLP
分类号: S666
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
下　载: 322次
引　用: 5次
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内容摘要

柑橘是我国重要的经济作物，其产量位居世界第3位。病害一直是作物生产的主要问题。在现有的柑橘栽培品种中抗病资源有限，如何从近缘属中克隆到相应的抗病基因是未来进行转基因抗病育种的关键问题。提高植物抗病性是植物育种的重要目标之一。随着现代生物技术的不断发展，利用植物基因工程进行植物抗病育种已经成为一种重要手段。到目前，人们已经通过图位克隆和转座子标签等方法分离克隆到一些植物抗病基因。本研究是根据已克隆的植物抗病基因保守序列设计简并引物，用PCR及RT—PCR的方法从柑橘抗病材料中扩增出抗病基因类似物(resistance gene analog，RGA)，并对其中部分RGA的碱基序列及其编码的氨基酸序列进行了分析。同时随机挑选了一个RGA作为探针，进行基因组RFLP分析，所取得的主要结果如下： 1．建立了提取总RNA的体系。经凝胶电泳和紫外分光光度计检测，其总RNA的质量基本达到分子生物学实验技术要求，能够用于RT—PCR分析及Northern杂交分析。 2．根据已知抗病基因保守结构域设计了多对简并引物。采用PCR方法，分别从枳壳、九里香、黄皮、国庆1号基因组及枳壳、国庆1号的cDNA中扩增得到以500bp为主的电泳带(特征带)。分析全部的PCR结果发现，所有的引物对均能在感病材料或抗病材料基因组DNA及它们cDNA中扩增到以500bp为主带的电泳图。因此，用现有的简并引物无法直接对感病和抗病材料进行抗病基因的筛选，可能需要进一步设计特异性更高的引物来进行筛选。 3．分别对枳壳基因组DNA PCR产物及RT—PCR产物克隆成功的重组子进行测序。将得到的25个RGA采用美国国立生物技术信息中心BLAST程序及DNAsis软件进行分析发现：所有的RGA与已克隆的部分植物抗病基因(水稻Xa1、拟南芥RPS2、烟草N、亚麻L6)在碱基序列和氨基酸序列上均有一定程度的同源性(5.7％-25.3％)；RGAs之间也存在很高的同源性(27.2％-100％)。如何进一步对这些RGAs进行筛选还有待研究。 4．选取RGAn-17-2作为探针，进行柑橘基因组DNA的RFLP分析。从杂交结果可以看出：RGAn-17-2在不同的柑橘材料(枳壳、九里香、黄皮、国庆1号)中都有若干同源片段。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-7
缩略词表  7-8
1 前言  8-16
  1.1 课题的提出  8
  1.2 国内外研究进展  8-15
    1.2.1 植物抗病与感病的机理  8-9
    1.2.2 抗病基因的克隆  9
    1.2.3 植物抗病基因克隆的技术  9-10
      1.2.3.1 转座子标签技术  10
      1.2.3.2 定位克隆技术  10
    1.2.4 已克隆到的植物抗病基因  10-12
    1.2.5 已克隆到的植物抗病基因产物的结构特征及其功能  12-13
      1.2.5.1 核苷酸结合位点(NBS)  12
      1.2.5.2 亮氨酸富集区(LRR)  12-13
      1.2.5.3 亮氨酸拉链(LZ)和TIR  13
      1.2.5.4 STK类基因  13
      1.2.5.5 跨膜受体激酶(LRR-TM-PK)  13
    1.2.6 R基因类似序列的研究现状  13-14
    1.2.7 抗病基因介导的抗病信号转导  14-15
      1.2.7.1 R基因与avr基因相互识别产生信号  14
      1.2.7.2 R基因介导信号转导过程  14-15
  1.3 本研究的目标和内容  15-16
    1.3.1 研究目标  15
    1.3.2 研究内容  15-16
2 材料及方法  16-23
  2.1 材料  16
  2.2 方法  16-23
    2.2.1 引物的设计  16
    2.2.2 总DNA的提取  16-17
    2.2.3 PCR扩增  17
    2.2.4 总RNA的提取及RT-PCR  17-19
      2.2.4.1 总RNA的提取  17-19
      2.2.4.2 cDNA的合成  19
      2.2.4.3 PCR扩增  19
    2.2.5 特异带的回收  19
    2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备  19-20
    2.2.7 回收产物的克隆  20
      2.2.7.1 连接  20
      2.2.7.2 连接产物转化大肠杆菌  20
    2.2.8 质粒DNA的提取及酶切  20-21
    2.2.9 DNA测序及序列分析  21
    2.2.10 Southern blot  21-23
3 结果与分析  23-30
  3.1 总RNA的提取  23
  3.2 特异PCR及RT-PCR体系参数的优化  23-25
  3.3 RGA的分离和克隆  25-26
  3.4 枳壳抗病基因同源序列的分析及与已知抗病基因比较  26-28
  3.5 枳壳抗病基因同源序列RGA的RFLP分析  28-30
4 讨论  30-32
  4.1 总RNA的提取方法的改进  30
  4.2 RGA的克隆及其分析  30-31
  4.3 对植物抗病基因工程的思考  31-32
参考文献  32-38
附表  38-47
致谢  47

利用同源序列法克隆柑橘抗病基因类似物及其初步分析

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