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核盘菌弱毒相关病毒基因组分子生物学特性的初步研究

作　者: 卫冬妹
导　师: 姜道宏
学　校: 华中农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 核盘菌 SsHV 弱毒相关dsRNA 真菌病毒
分类号: S432
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
下　载: 235次
引　用: 4次
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内容摘要


本文对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)Ep-1PN菌株弱毒相关dsRNA进行了cDNA克隆，分析了该序列的结构特性，并与其它相近病毒的基因组进行了同源性比较，在分子水平上进一步探讨真菌病毒与核盘菌弱毒现象的关系。研究结果报道如下： 1 采用RT-PCR及cDNA克隆技术对弱毒菌株Ep-1PN的6.4kb dsRNA片段进行了cDNA克隆，得到了多个阳性克隆，通过序列测定及拼接，获得了该dsRNA基因组含有4629bp的核苷酸的序列，并已在GenBank登录注册(登录号为AY147260)。 2 4629bp的RNA序列中包含一个推定的不完整的阅读框架(ORF)，编码含有1440个氨基酸残基的Helicase-RdRp融合蛋白，在已获得的核苷酸序列中没有发现编码病毒外壳蛋白性质的基因。 3 对核酸序列同源性进行比较(Blast)发现，核盘菌弱毒相关dsRNA序列与植物病毒Potexvirus组中的病毒有较高的同源性，这些植物病毒包括BaMV(Bamboo mosaic virus)、PVX(Potato vires X)、CIYMV(Clover yellow mosaic virus)和TuVX(Tulip virus X)等。对推定的Helicase和RdRp的氨基酸序列进行同源性比较也证实了核盘菌弱毒相关dsRNA与植物病毒有较高的同源性，而与典型的真菌病毒存在较大的差异。因此，我们推定弱毒菌株Ep-1PN感染了类似植物病毒的真菌病毒，并将其命名为核盘菌弱毒相关病毒，缩写为SsHV(S.sclerotiorum hypovirulence-associated virus)。 4 根据SsHV已知的核苷酸序列设计特异引物，对Ep-1PN及其恢复菌株进行RT-PCR，这些恢复菌株包括有性后代Ep-1PNAa、Ep-1PNAb、Ep-1PNAe，原生质体再生菌株Ep-1PNP14、Ep-1PNP94、Ep-1PNP131，以及单菌核分离物Ep-1PNSSB9。结果在原生质体再生菌株Ep-1PNP131和单菌核分离物Ep-1PNSSB9中均检测到相同的特异性扩增片段，大小为871bp，与前面所得到的Ep-1PN核苷酸序列大小相符。这两个菌株在表型上与核盘菌正常菌株相比具有一定的差异，属于部分恢复菌株。而在形态、生长速度及毒力恢复正常的另外两个原生质体再生菌株Ep-1PNP14、Ep-1PNP94及子囊孢子单孢分离物Ep-1PNAa、Ep-1PNAb、Ep-1PNAe中均没有扩增到特征性片段。结果表明，核盘菌在进行有性遗传时可能激活其体内某种未知的机制，摆脱弱毒相关真菌病毒的影响，通过原生质体再生技术也可获得不携带真菌病毒的核盘菌衍生后代。与Ep-1PN相比，采用常规dsRNA提取方法从Ep-1PNP94和Ep-1PNSSB9的菌丝样品中难以检测到dsRNA，据此可推定SsHV的浓度可能会影响核盘菌的表型。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-8
第一章 文献综述  8-18
  1 核盘菌研究进展  8-10
    1.1 核盘菌的寄主范围  8
    1.2 核盘菌的生物学特性  8
    1.3 核盘菌的致病作用及其寄主的抗性  8-9
    1.4 作物菌核病的防治  9-10
  2 真菌病毒或dsRNA及其介导的植物病原真菌弱毒现象的研究进展  10-16
    2.1 真菌病毒或dsRNA  10-12
    2.2 植物病原真菌的弱毒现象及其与真菌病毒或dsRNA的关系  12-14
    2.3 真菌病毒或dsRNA与寄主的互作  14-15
    2.4 弱毒株的生防潜能  15-16
  3 核盘菌弱毒株Ep-1PN的研究进展  16-17
  4 研究目的及意义  17-18
第二章 核盘菌Ep-1PN菌株病毒基因组cDNA克隆及序列分析  18-43
  1 材料及方法  18-26
    1.1 材料  18-19
      1.1.1 核盘菌Ep-1PN菌株及其培养基  18
      1.1.2 细菌菌株及培养基  18
      1.1.3 载体、抗性标记、引物及分子标记  18-19
      1.1.4 缓冲液  19
      1.1.5 酶及其它试剂和试剂盒  19
    1.2 方法  19-26
      1.2.1 菌株培养  19-20
      1.2.2 dsRNA的粗提取  20
      1.2.3 dsRNA的纯化  20-21
      1.2.4 用随机引物或特定引物对dsRNA序列进行cDNA克隆  21
      1.2.5 cDNA克隆的Northern杂交鉴定  21-22
      1.2.6 用特异引物对dsRNA进一步作cDNA克隆  22-23
      1.2.7 用特异引物对对dsRNA序列进行RT-PCR克隆  23
      1.2.8 dsRNA近末端序列的克隆  23
      1.2.9 目的片段的回收及纯化  23-24
      1.2.10 PCR产物的A-Tailing  24
      1.2.11 PCR产物与克隆载体的连接  24
      1.2.12 利用大肠杆菌感受态细胞转化连接产物  24
      1.2.13 重组质粒DNA的提取及鉴定  24-25
      1.2.14 亚克隆  25
      1.2.15 克隆的测序  25
      1.2.16 dsRNA基因组序列的拼接和分析  25-26
  2 结果与分析  26-41
    2.1 核盘菌Ep-1PN dsRNA及其与弱毒性的关系  26
    2.2 重要dsRNA 6.4kb片段的cDNA克隆  26-28
    2.3 SS15的RT-PCR延伸  28
    2.4 SS15的cDNA克隆延伸  28-29
    2.5 Northern杂交鉴定  29-30
    2.6 dsRNA 6.4kb片段5'端和3'端的克隆  30-31
    2.7 cDNA克隆间的拼接  31-36
    2.8 推定的蛋白质功能分析  36-37
    2.9 SsHV编码的Helicase及RdRp同源性比较  37-41
  3 结论与讨论  41-43
    3.1 结论  41
    3.2 讨论  41-43
第三章 核盘菌Ep-1PN及其衍生菌株核酸RT-PCR比较分析  43-48
  1 材料与方法  43-45
    1.1 材料  43
      1.1.1 菌株及其培养基  43
      1.1.2 酶及其它试剂  43
    1.2 方法  43-45
      1.2.1 菌株培养  43
      1.2.2 总RNA的提取  43
      1.2.3 总RNA的纯化  43-44
      1.2.4 RNA的RT-PCR检测  44-45
  2 结果与分析  45-47
    2.1 Ep-1PN及其衍生菌株的总RNA  45
    2.2 RT-PCR分析  45-47
  3 结论与讨论  47-48
研究前景展望  48-49
参考文献  49-57
致谢  57

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物病害及其防治
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