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海洋细菌Bacillus velezensis DM09在油菜中的定植及对油菜菌核病的防治研究

作　者: 郭春艳
导　师: 喻子牛；张吉斌
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 海洋细菌 Bacillus velezensis DM09 核盘菌生物防治诱导系统抗性
分类号: S435.654
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

油菜菌核病是由核盘菌(Sclerotinia Sclerotiorum(Lib)de Bary)侵染引起的,是我国油菜的主要病害之一。油菜感染菌核病后,可直接导致减产5%-30%,含油量降低1%-5%。我国每年发病面积约470万hm2,直接经济损失达数亿元。由于化学农药防治存在污染环境、在食物链中残留、防效低、病原菌容易产生耐药性等问题,寻找有效的拮抗核盘菌的生物农药成为热点。本文以Bacillus velezensis DM09为材料,对其抗真菌活性物质的理化特性、DM09在油菜体内的定植、诱导抗性以及对油菜菌核病的防治作用等进行了研究。从深海海水中分离得到的Bacillus velezensis DM09经MB培养基活化,在PD液体培养基中发酵后,发酵滤液具有广泛的抗真菌能力。DM09所产的抗真菌活性粗提物在4℃保存60 d、100℃处理30 min,其抗真菌活性不变；对蛋白酶K和胰蛋白酶不敏感；在pH 7-10的范围内,有较好的活性；对紫外线不敏感。油菜离体叶片实验表明,DM09发酵滤液能控制油菜核盘菌菌丝的生长,且能有效的降低发病率,防效达92.51%；DM09活菌体对油菜核盘菌的拮抗作用不明显,防效均在25%以下；发酵菌悬液的防效和发酵滤液相当。DM09通过灌根接种法,能在油菜茎和叶内稳定定植。1×105 CFU/mL芽胞悬液为最适的接种浓度。接种后第20 d,体内菌数达到(7.1±0.30)×103CFU/g鲜植株,50 d时为(5.16±0.61)×103CFU/g鲜植株。DM09通过叶面喷菌法,也能在油菜茎和叶定植,定植数量与灌根接种法相当。DM09在油菜根内定植数量极少。DM09在油菜体内定植后,能增强油菜对核盘菌的抵抗能力。具体表现为能明显抑制核盘菌菌丝的生长,防效达到54.58%。油菜接种DM09或经DM09发酵液上清处理后,再接种S. Sclerotiorum,与空白组相比,发病率和菌斑面积有显著的降低,且POD (peroxidase)、PPO (polyphenol oxidase)的酶活与空白组相比,有明显的提高。诱导系统抗性(ISR)是DM09防治油菜核盘菌的机制之一。

全文目录

摘要  7-8
Abstract  8-10
缩写词表  10-11
1 前言  11-26
  1.1 油菜菌核病的危害及生物防治  11-13
    1.1.1 油菜菌核病的危害  11
    1.1.2 油菜菌核病的发生规律  11-13
    1.1.3 油菜菌核病的发病机制  13
  1.2 油菜菌核病的防治  13-16
    1.2.1 培育和利用抗病品种  13
    1.2.2 化学防治  13-14
    1.2.3 生物防治  14-16
      1.2.3.1 生防真菌  14-15
      1.2.3.2 生防细菌  15-16
  1.3 芽胞杆菌脂肽:植物病害生物防治的多功能武器  16-24
    1.3.1 脂肽的主要来源——芽胞杆菌  16-18
    1.3.2 脂肽的结构及其活性  18-19
    1.3.3 脂肽协助其产生菌定植  19-20
    1.3.4 脂肽对植物病原菌的直接拮抗作用  20-21
    1.3.5 脂肽诱导植物抗性  21-24
    1.3.6 脂肽的原位产生与其产生菌生境的关系  24
  1.4 研究的目的与意义  24-26
2 材料与方法  26-37
  2.1 材料  26-29
    2.1.1 Bacillus velezensis DM09来源  26
    2.1.2 植物病原真菌  26
    2.1.3 作物  26-27
    2.1.4 主要试剂  27
    2.1.5 培养基及常用溶液  27-29
    2.1.6 实验仪器  29
  2.2 方法  29-37
    2.2.1 DM09抗真菌谱的确定  29-30
    2.2.2 DM09抗油菜核盘菌特性  30
    2.2.3 DM09最佳发酵时间的确定  30
    2.2.4 DM09抗真菌活性粗提物的制备  30
    2.2.5 DM09抗真菌活性物质的稳定性测试  30-31
      2.2.5.1 热对抗真菌活性物质的影响  30
      2.2.5.2 pH对抗真菌活性物质的影响  30-31
      2.2.5.3 蛋白酶对抗真菌物质活性的影响  31
      2.2.5.4 抑制剂对抗真菌物质活性的影响  31
      2.2.5.5 存放时间对抗真菌物质活性的影响  31
      2.2.5.6 紫外线对抗真菌物质活性的影响  31
    2.2.6 DM09对油菜核盘菌的生物防治(离体叶片试验)  31-32
      2.2.6.1 DM09发酵上清液对油菜核盘菌的生防作用  31-32
      2.2.6.2 DM09发酵菌悬液对油菜核盘菌的生防作用  32
      2.2.6.3 DM09菌体对油菜核盘菌的生防作用  32
    2.2.7 DM09的抗性试验及水解纤维素能力测试  32
    2.2.8 DM09在油菜体内的定植  32-33
    2.2.9 DM09在油菜体内的定植动态  33
      2.2.9.1 DM09在油菜体内的定植数量与接种浓度的关系  33
      2.2.9.2 DM09在油菜体内定植数量的时间稳定性试验  33
    2.2.10 DM09叶面喷菌液定植  33
    2.2.11 DM09定植后油菜植株对核盘菌的防御能力研究  33-34
    2.2.12 DM09在土壤中的存在情况  34
    2.2.13 DM09对油菜诱导系统抗性相关防御酶系的影响实验设计  34-35
    2.2.14 酶粗提液的制备  35
    2.2.15 防御相关酶活性变化测定  35-37
      2.2.15.1 过氧化物酶(POD)活性的测定  35-36
      2.2.15.2 多酚氧化酶(PPO)活性的测定  36
      2.2.15.3 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的测定  36-37
3 结果与分析  37-59
  3.1 DM09抗真菌谱的确定  37-38
  3.2 DM09抗油菜核盘菌的特性  38-39
  3.3 DM09最佳发酵时间的确定  39
  3.4 DM09抗真菌活性物质的稳定性测试  39-42
    3.4.1 热对抗真菌活性物质的影响  39-40
    3.4.2 pH对抗真菌活性物质的影响  40
    3.4.3 蛋白酶对抗真菌物质活性的影响  40-41
    3.4.4 抑制剂对抗真菌物质活性的影响  41-42
    3.4.5 存放时间对抗真菌物质活性的影响  42
    3.4.6 紫外线对抗真菌物质活性的影响  42
  3.5 DM09对油菜核盘菌的生物防治(离体叶片试验)  42-46
    3.5.1 DM09发酵上清液对油菜核盘菌的生防作用  42-44
    3.5.2 DM09发酵菌悬液对油菜核盘菌的生防作用  44-45
    3.5.3 DM09菌体对油菜核盘菌的生防作用  45-46
  3.6 DM09的抗性试验及水解纤维素能力测试  46
  3.7 DM09在油菜体内的定植  46-47
  3.8 DM09在油菜体内的定植动态  47-49
    3.8.1 DM09在油菜体内的定植数量与接种浓度的关系  47-48
    3.8.2 DM09在油菜体内定植数量的时间稳定性试验  48-49
  3.9 DM09叶面喷菌液定植  49
  3.10 DM09定植后油菜植株对核盘菌的防御能力研究  49-50
  3.11 DM09在土壤中的存在情况  50
  3.12 DM09对油菜诱导系统抗性相关防御酶系的影响实验中病情统计  50-51
  3.13 第一大组POD、PPO、PAL酶活性的变化  51-55
  3.14 第二大组POD、PPO、PAL酶活性的变化  55-59
    3.14.1 POD酶活性的变化  55
    3.14.2 PPO酶活性的变化  55
    3.14.3 PAL酶活性的变化  55-59
4 讨论  59-62
  4.1 DM09抗真菌粗提物的性质及对油菜核盘菌的生物防治  59
  4.2 DM09在油菜体内的定植  59-60
  4.3 DM09对油菜诱导系统抗性相关防御酶系的影响  60-62
参考文献  62-69
致谢  69

海洋细菌Bacillus velezensis DM09在油菜中的定植及对油菜菌核病的防治研究

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